[发明专利]肺部递送mRNA至非肺靶细胞

说明书

相关申请

本申请要求2012年6月8日提交的美国临时申请第61/657,452号的权益，该申请的内容以引用的方式并入本文。

背景

常规基因疗法涉及使用DNA来将所需遗传信息插入宿主细胞中。引入细胞中的DNA通常整合至一个或多个转染细胞的基因组中，从而允许所引入的遗传物质在宿主中的长效作用。虽然这类持续作用可具有大致上益处，但是外源性DNA整合至宿主基因组中也可具有许多有害效应。举例来说，可能所引入的DNA将插入完整基因中，导致阻碍或甚至完全消除内源性基因的功能的突变。因此，使用DNA的基因疗法可导致损害所治疗宿主的重要遗传功能，如例如，消除或有害减少必需酶的产生或干扰对于细胞生长的调控起关键作用的基因，从而导致未经调控的或癌性的细胞增殖。另外，使用常规基于DNA的基因疗法，为了有效表达所需基因产物，必需包括强的启动子序列，这也可导致细胞中的正常基因表达的调控的不当变化。也可能基于DNA的遗传物质将导致诱导不需要的抗-DNA抗体，进而可触发可能致命的免疫响应。

与DNA相比，使用RNA作为基因治疗剂大致上更安全，因为(1)RNA不涉及稳定整合至转染细胞的基因组中的风险，由此消除了所引入的遗传物质干扰必需基因的正常运作或导致引起有害或致癌效应的突变的顾虑；(2)外来的启动子序列不为有效翻译编码蛋白质所需要，再次避免了可能有害的副作用；(3)与质粒DNA(pDNA)相比，信使RNA(mRNA)没有免疫原性CpG基元以使得不产生抗-RNA抗体；并且(4)由于RNA的半衰期相对较短，确实由基于mRNA的基因疗法产生的任何有害效应具有有限的持续时间。此外在许多应用中，mRNA的瞬时性质转移至细胞，即，其中任何治疗效果的持续时间受mRNA和细胞中的蛋白质产物的寿命限制，从而比使用基于DNA的基因疗法获得的潜在更长持续效应更合乎需要。另外，不必需要mRNA进入细胞核来进行它的功能，因而避免基于DNA的基因疗法的主要障碍。

基于mRNA的基因疗法在过去未更多使用的一个原因是mRNA的稳定性比DNA小得多，尤其在它到达细胞的细胞质并且暴露于降解酶时。mRNA中的糖部分的第二碳上的羟基的存在导致空间位阻，从而防止mRNA形成DNA的更稳定双螺旋结构，因而使得mRNA更倾向于水解降解。因此，直到最近，广泛地认为mRNA太不稳定以致于不能经受住转染方案。

RNA稳定修饰的进展引起在基因疗法中使用mRNA代替质粒DNA的更多关注。然而，尽管修饰mRNA的稳定性增加，但是在体内以允许产生治疗水平蛋白质的方式将mRNA递送至细胞仍然是难题，尤其对于编码全长蛋白质的mRNA。使用将mRNA引入宿主中的病毒载体来已经获得了一些成功，然而使用病毒载体的mRNA转染可产生不利免疫响应。在一些情况下，病毒载体甚至可整合至宿主基因组中。另外，临床等级病毒载体的产生也昂贵并且费时。所引入的遗传物质使用病毒载体的靶向递送还可能难以控制。

mRNA的非病毒递送可使用注射裸核酸、多聚复合物、脂质复合物或脂质体包埋mRNA、经由基因枪的生物弹射递送、微粒载体介导递送和电穿孔来实现。与递送mRNA的病毒载体相比，非病毒转染或递送媒介物总体上毒性更小、免疫原性更小，并且制备更容易和更便宜。某些递送媒介物，如阳离子脂质或聚合物递送媒介物还可有助于保护所转染的mRNA使之免于内源性RNA酶。

核酸的脂质体递送已经用作实现基于经包封的质粒DNA、反义寡核苷酸、短干扰RNA和微小RNA疗法的位点特异性递送的手段。然而，高效的、治疗有效递送mRNA至靶细胞和组织以及随后转染这类靶细胞和组织仍然是技术难题，尤其对于递送编码全长蛋白质的mRNA。重要的是设计如下脂质体递送系统，它提供到达所需靶细胞的足够稳定性和将其包封材料有效地释放至这类靶细胞以允许在治疗有效水平下翻译功能性蛋白质的能力。

用于构建这类基于脂质体的递送媒介物的许多阳离子脂质在用于递送治疗有效量的包封剂时对于靶细胞具有毒性。因此，与阳离子脂质相关联的毒性代表其一般用作非病毒递送媒介物的显著障碍，尤其在将治疗有效量的mRNA成功递送至靶细胞所必需的数量下。