[发明专利]具有药理学活性的纳米构建物

说明书

说明

本发明涉及在细胞胞质溶胶中转运活性物质的方法和工具。具体地，本发明涉及的工具，其能够在细胞胞质溶胶中直接转运与蛋白质系统相互作用的物质，如位于胞质溶胶内的核酸或活化T细胞的核因子(NFAT)家族。具体地，本发明涉及用于治疗炎性疾病的纳米构建物，它们的制备方法，以及含有它们的组合物。

现有技术

胞质溶胶

胞质溶胶是细胞器的胞质中，由矿物盐，有机分子，大分子和蛋白质的溶液形成的可溶部分。对于细胞和生命体的生理学特性至关重要的生物化学反应一般发生在该细胞隔室内。发生在此细胞胞质溶胶中的反应包括来自Ca²⁺/钙调蛋白依赖性磷酸酶钙依赖磷酸酶(Cn)蛋白质的NFAT蛋白的去磷酸化反应。

NFAT

NFAT蛋白是指由成员NFAT1(NFATc2)、NFAT2(NFATc1)、NFAT3(NFATc4)和NFAT4(NFATc3)，以及它们的各种同种型构成的转录因子家族的成员。NFAT家族的蛋白在进化学上与转录因子的REL-NF-κB家族相连。NFAT蛋白最初鉴定为能够调节T细胞的IL-2产生的转录因子，虽然此后鉴定到NFAT关于适应性免疫的各种功能，包括B和T-细胞的分化和活化。

NFAT是在嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞(DC)中对凝乳聚糖(Curdian)起反应而被激活，但也在DC中对LPS起反应而被激活和在巨噬细胞中由TNFα调节。

同种型1-4的活性受钙依赖磷酸酶(Cn)控制，其是Ca²⁺/钙调蛋白依赖性磷酸酶，一旦被激活，会增加细胞内Ca²⁺浓度并使得存在于NFAT的N-末端的磷酸化基序脱磷酸化，表达用于确定NFAT的核输入的核序列。NFAT蛋白与统称为NFATn的伴侣蛋白相互作用以产生活性NFAT转录因子复合物和在随后的分析中，控制细胞因子的产生。

慢性和炎性自身免疫性疾病以及与移植排斥相关的问题通常使用免疫抑制药物治疗，包括环孢菌素A(CSA)和FK506，它们是活化的免疫细胞内细胞因子基因转录的强效抑制剂。环孢素A和FK506抑制Cn的活性。然而，它们有很明显的副作用。环孢素导致小血管的血管病变，尤其是肾脏内，并因高血压和高血脂导致大血管的血管病变，而FK506可导致肾毒性，神经毒性，糖尿病和高血压。这些药物的高水平毒性的原因在于Cn的普遍表达，并且Cn不仅控制NFAT，还控制其它转录因子的活化。

因此需要新的，毒性较低的免疫抑制药物，能同时特异性抑制NFAT前体，抑制免疫反应激活所需的关键炎性分子的表达。

VIVIT

具有序列为Pro-X-Ile-X-Ile-Thr(PxIxIT)的肽，从在NFAT蛋白质中发现的隐藏的Cn-结合基序衍生而来，与NFAT竞争结合Cn，从而在酶的测定中显示破坏NFAT的结合和脱磷酸化。特别是，已经证明16聚体形式的寡肽缬氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-苏氨酸(VIVIT)对Cn的亲和力增加并能有效抑制NFAT和其活性，但不抑制NF-κB转录因子的活性，由各自的报道基因的激活所指示(Aramburu等，Science，1999)。因此，VIVIT肽比CsA和FK506更具选择性，其同时抑制这两种转录因子的活化。实际上，专利申请WO2008156363描述了包含VIVIT序列的各种构建物以便用于炎症的一般治疗。

但是，众所周知的是，肽材料无法独立通过细胞膜，来直接转移进胞质溶胶，并且在任何情况下，有众所周知的体内稳定性问题，这限制了这类材料的使用。在本申请的实验部分报道的结果已证实，包含VIVIT序列的肽不能到达目标Cn蛋白所位于的细胞胞质溶胶，其量足以有效地作为炎性过程的抑制剂(塞伯等，细胞通讯和信号传导(Cell communication and signaling)：CCS，2009)。

纳米粒子。具有纳米级尺寸范围的固体粒子构成一个有效的载体系统用于活性分子的运输是已知的。一旦结合到纳米粒子，这类分子被保护免受体内降解，可在细胞内运输和释放。

治疗/诊断领域中使用的多数纳米粒子可分为两大类：即含有有机分子作为主要成分的粒子，和那些使用无机元素，通常是金属，作为核的粒子。属于后一组的粒子具有许多优点，包括：1)利用所述晶核，以便获得相关物理性质的可能性，2)所述无机核能够有效控制最终纳米构建物的尺寸和形态特征。