[发明专利]无染色剂蛋白定量和标准化

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2012年4月27日提交的标题为“Stain-free total protein quantification of complex samples from diverse sources(来自多种来源的复杂样品的无染色剂总蛋白定量)”的美国临时申请号61/639,692的优先权，其全部内容通过引用纳入本文以用于所有目的。本申请还要求2012年4月27日提交的标题为“Stain-free technology for western blot total normalization(用于western印迹总体标准化的无染色剂技术)”的美国临时申请号61/639,686的优选权，其全部内容通过引用纳入本文以用于所有目的。

发明背景

生物技术中的实验室过程通常包括单个蛋白的检测、鉴定和定量。然而，除各混合物中的单个蛋白外，某些步骤还需要对整个蛋白混合物进行定量，同时需要或不需要使单个蛋白彼此分离或区分。这类总蛋白定量是有价值的，例如在比较来自不同样品的蛋白量时，包括来自不同对象、不同生物体和不同物种，或者来自处于不同发育阶段或疾病或疾病病症的不同阶段的同一物种或对象的样品。在这些情况下，总蛋白测定可揭示基因表达的定量变化，在诊断、治疗和治疗剂的测试中具有价值。总蛋白测定也可用于检测分析系统中的样品加载和蛋白转移。例如，在将样品加载至微孔板的单个孔或电泳凝胶的单条泳道中时，需要多个孔或泳道间具有均一和恒定的加载量以确保对样品所进行的任何分离或其他步骤中能够做出适当的比较。蛋白转移在例如Western印迹中发生，这也是受关注的领域，因为总蛋白定量可显示印迹是否正确实施，或是否出现了不完全转移。

使用常规染色剂(如COOMASSIE^TM亮蓝(巴斯夫公司(BASF Aktiengesellschaft)，德国路德维希)、Ponceau S(西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)，美国密苏里州圣路易斯)和SYPRO RUBY^TM(西格玛-艾尔德里奇公司)的蛋白检测和定量是已知的。Edwards等在美国专利号US 7,569,103B2(2009年8月4日)和US 8,007,646B2(2011年8月30日)中公开了无染色剂技术，其中引发色氨酸的吲哚部分和多个卤素取代的有机化合物中任意一个(特别提到了氯仿、三氯乙醇和三氯乙酸)之间的UV光诱导的反应以生成发射波长在可见光范围内的荧光化合物。该技术因此包括使用含卤素试剂处理蛋白或其中存在蛋白的凝胶，使蛋白或凝胶暴露于UV光，并对所得单个蛋白条带的发射光进行检测和定量。

色氨酸在蛋白中相对稀少，且各蛋白中色氨酸残基与总氨基酸残基的比例彼此间差异很大。基于此，对目前无染色剂技术应用的认识受到了限制。因此，已知该技术可用于比较同一蛋白的不同样品，例如，通过比较各样品中相同分子量蛋白的单个条带的强度。不同样品中不同蛋白条带之间的比较是徒劳的，因为不同蛋白很可能具有不同的色氨酸含量，因此无法预期在以相同量存在时产生相同的信号强度。然而，色氨酸差异不必然限制该技术在单个蛋白比较中的应用。对来自同一来源的样品进行测定时，总蛋白测定是有效的。该技术可用于印迹实验中，例如用于比较印迹前后凝胶中的无染色剂信号以确定任何蛋白是否仍存在于凝胶中。通过使用蛋白的已知浓度范围构建标准曲线并评估含未知量同一蛋白的样品(前提是样品中的蛋白量在标准曲线的范围内)，该技术还可用于绝对定量。然而，在所有情况下，比较都是同一样品在一些操作前后或者不同样品中同一单个蛋白之间的直接比较。在这些情况下，不同蛋白之间色氨酸含量的任何差异都不会否定结果的有效性。

在研究样品中感兴趣的单个蛋白时，有时相对于样品中一种或多种其他蛋白或者相对于样品中的全部蛋白对该蛋白量进行标准化是有益处的。标准化是一种校正实验数据的方法，以适应样品稀释、样品加载或蛋白转移不一致中的差异。例如，如果两种不同细胞培养物被用作样品，可能各培养物含有不同的细胞数目。如果两种样品中各细胞含有相同量的特定蛋白，则含有更多细胞的培养物含有更多的蛋白。在不知道一种样品所含细胞多于另一种样品的情况下，会不正确地总结出一种培养物中的平均细胞含有的蛋白多于另一种培养物中的平均细胞。标准化用于校正这类差异。