[发明专利]核酸样品制备

说明书

交叉引用

本申请要求2012年4月16日提交的美国临时申请号61/624,897的权益，该申请通过引用并入本文。

背景技术

近年来，在DNA测序领域已取得了指数式的迅速进展。诸如焦磷酸测序、离子半导体测序和聚合酶克隆测序(polony sequencing)等方法旨在将成本降低至使完整基因组测序成为常规的程度。预期这将使诸多领域(仅举几个例子)如医学、可再生能源、生物安全和农业发生变革。然而，用于分离适于测序的DNA的技术未能跟上步伐，并存在将成为限制因素的威胁。

发明内容

在一些情况下，本发明满足了对从生物样品中分离核酸的改进方法的需求。本文提供的某些方面的具体特性包括少于约一小时的总样品制备时间，以及少于约一分钟的操作时间(hands-on time)。在一些实施方案中，本发明可用于从稀的和/或复杂的流体如血液或环境样品中分离DNA。在其他方面，本发明可使用少量的起始材料，得到高度纯化的核酸，并且可用于多路和高通量操作。

在一些实施方案中，本文公开了一种从包含细胞的流体中分离核酸的方法，该方法包括：a.将流体施加到装置上，该装置包含能够产生AC动电场(electrokinetic field)的电极阵列；b.使多个细胞集中在第一AC动电场区内；c.在第一AC动电场区内裂解细胞；以及d.在第二AC动电场区内分离核酸，其中所述流体具有能够使多个细胞集中在第一AC动电场区内的电导率。在一些实施方案中，第一AC动电场区是介电电泳场区(dielectrophoretic field region)，其中第二AC动电场区是介电电泳场区，或其组合。在一些实施方案中，第一AC动电场区是第一介电电泳低场区，且第二AC动电场区是第二介电电泳高场区，其中所述流体的电导率大于300mS/m。在一些实施方案中，第一AC动电场区是第一介电电泳高场区，且第二AC动电场区是第二介电电泳高场区，其中所述流体的电导率小于300mS/m。在一些实施方案中，核酸集中在第二AC动电场区内。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从阵列和分离的核酸中冲洗残余物质。在一些实施方案中，所述方法进一步包括残余蛋白质的降解。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从阵列和分离的核酸中冲洗降解的蛋白质。在一些实施方案中，所述方法进一步包括收集核酸。在一些实施方案中，第一AC动电场区由交流电产生。在一些实施方案中，使用具有1伏至40伏峰-峰值的电压和/或5Hz至5,000,000Hz的频率和5％至50％的占空比的交流电产生第一AC动电场区。在一些实施方案中，第二AC动电场区是与第一AC动电场区不同的电极阵列区。在一些实施方案中，第二AC动电场区是与第一AC动电场区相同的电极阵列区。在一些实施方案中，第二AC动电场区由交流电产生。在一些实施方案中，使用具有1伏至50伏峰-峰值的电压；和/或5Hz至5,000,000Hz的频率，和5％至50％的占空比的交流电产生第二AC动电场区。在一些实施方案中，使电极选择性地通电以提供第一AC动电场区，并在随后或连续地选择性地通电以提供第二AC动电场区。在一些实施方案中，通过向细胞施加直流电裂解细胞。在一些实施方案中，用于裂解细胞的直流电具有1-500伏的电压；以及施加一次的或作为多个脉冲施加的0.01至10秒的持续时间。在一些实施方案中，用于裂解细胞的直流电是以适于裂解细胞的频率施加的一个直流电脉冲或者多个直流电脉冲。在一些实施方案中，该脉冲具有0.2至200Hz的频率，且占空比为10-50％。在一些实施方案中，使用直流电、化学裂解剂、酶裂解剂、热、渗透压、声能或其组合在装置上裂解细胞。在一些实施方案中，残余物质包含裂解的细胞物质。在一些实施方案中，裂解的细胞物质包含由多个细胞经裂解释放的残余蛋白质。在一些实施方案中，电极阵列涂覆有水凝胶。在一些实施方案中，水凝胶包含两层或更多层合成聚合物。在一些实施方案中，水凝胶旋涂于电极上。在一些实施方案中，水凝胶在旋涂之前具有约0.5cP至约5cP的粘度。在一些实施方案中，水凝胶具有约0.1微米至1微米的厚度。在一些实施方案中，水凝胶具有约0.1S/m至约1.0S/m的电导率。在一些实施方案中，电极阵列为点配置。在一些实施方案中，点之间的取向角为约25°至约60°。在一些实施方案中，电极阵列是波浪形或非线性线配置，其中该配置包含重复单元，该重复单元包含由连接体连接的一对点的形状，其中所述点和连接体限定电极的边界，其中所述连接体朝着或对着所述一对点之间的中点处向内逐渐变细，其中所述点的直径为沿重复单元长度的最宽处，其中一组平行的重复单元之间的边缘到边缘距离是等距的或大致等距的。在一些实施方案中，电极阵列包含相对介电常数为约2.0至约4.0的钝化层。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过聚合酶链反应扩增分离的核酸。在一些实施方案中，核酸包括DNA、RNA或其任意组合。在一些实施方案中，分离的核酸包含按质量计小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％或小于约2％的非核酸细胞物质和/或蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含按质量计大于约99％、大于约98％、大于约95％、大于约90％、大于约80％、大于约70％、大于约60％、大于约50％、大于约40％、大于约30％、大于约20％或大于约10％的核酸。在一些实施方案中，所述方法在少于约一小时内完成。在一些实施方案中，不使用离心。在一些实施方案中，通过化学降解和酶降解中的一种或多种来降解残余蛋白质。在一些实施方案中，用蛋白酶K降解残余蛋白质。在一些实施方案中，用酶降解残余蛋白质，所述方法进一步包括在蛋白质降解之后灭活该酶。在一些实施方案中，通过热(例如，50至95℃持续5-15分钟)灭活该酶。在一些实施方案中，在单独的或同时进行的步骤中冲洗残余物质和降解的蛋白质。在一些实施方案中，通过以下步骤收集分离的核酸：(i)关断第二AC动电场区；和(ii)以洗脱剂从阵列上洗脱核酸。在一些实施方案中，核酸以适于测序的形式进行分离。在一些实施方案中，核酸以适于鸟枪法测序的片段化形式进行分离。在一些实施方案中，所述包含细胞的流体具有低电导率或高电导率。在一些实施方案中，所述流体包括体液、血液、血清、血浆、尿、唾液、食物、饮料、生长培养基、环境样品、液体、水、克隆细胞或其组合。在一些实施方案中，所述细胞包括克隆细胞、病原体细胞、细菌细胞、病毒、植物细胞、动物细胞、昆虫细胞和/或其组合。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对分离的核酸进行测序。在一些实施方案中，通过Sanger测序、焦磷酸测序、离子半导体测序、聚合酶克隆测序、连接测序、DNA纳米球测序、连接测序或单分子测序对核酸进行测序。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对DNA进行反应(例如，片段化、限制性消化、连接)。在一些实施方案中，所述反应在阵列上或阵列附近或在装置内发生。在一些实施方案中，所述包含细胞的流体包含不超过10,000个细胞。