[发明专利]一种确定RNA完整性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对生物样品中RNA完整性(integrity)进行定量的方法，并且更特别地，涉及对mRNA完整性进行定量的方法。本发明的方法不仅有助于定量目的样品中RNA的完整性，而且提供了一种在考虑RNA降解程度的情况下校正mRNA表达之定量结果的手段。本发明的方法可用在多种应用中，包括但不限制于，提供更精确地测定mRNA表达水平的手段，例如在诊断或监测以mRNA水平改变表征之病症的情况下。

背景技术

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基因表达评估的精确性受起始RNA数量和质量的影响。RNA的纯度和完整性是基于RNA的分析整体成功的关键因素。以低质量的RNA开始可能严重危害下游应用的结果，其往往是劳动密集的、耗时的和高成本的。因此在分子生物学中以及在诊断应用中，优选使用高质量的完整RNA作为起始点。RNA的完整性应该在一些应用中进行检查，例如定量RT-PCR、RNA测序、微阵列、核糖核酸酶保护测定、原位杂交、northern印记分析、RNA作图、体外翻译、cDNA文库构建以及任何种类的测序或阵列应用。这个问题在具有独特的或有限的组织材料(例如，手术后获得的组织)的临床应用中尤为重要，其中需要可靠的RNA定量。

迄今为止，已经开发了很多方法使人们能够评估目的RNA群体的质量以确定其是否具有足够的质量以用于分析目的。例如，为了确定RNA的纯度，可以考虑OD_260nm/OD_280nm的比，但是，该参数仅提供了蛋白或苯酚污染的信息，而没有给出关于RNA完整性的适当的和充分的信息。几十年来，确定RNA降解水平的唯一方式是使用基于琼脂糖凝胶的电泳，但是这个方法易变、不精确、耗时并且成本高昂。

多种评估RNA完整性的方法基于测量相同或不同长度的不同种RNA的数目或者同一种RNA的不同片段的数目，然后得到与RNA完整性有关的数。最好的实例是3’：5’方法，其通过PCR测量由RNA分子3’片段和5’片段的扩增获得的Cq值并且使用这样获得的扩增子数目的比值作为RNA完整性的量度。

还使用自动化平台来评估RNA的完整性。目前，两种自动化系统可以用于这个目的：Experion(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)和2100Bioanalyzer(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)。这两种系统都是基于自动化的和微型化的电泳系统，由芯片实验室(Lab-on-chip)技术实现。这两种平台通过使用核糖体28S/18S的比或者代表RNA完整性的数字系统来确定RNA的质量。Agilent Technologies为2100Bioanalyzer提供了RIN算法(RNA完整性数，RNA Integrity Number)，而Bio-Rad最近开发了一种新的Experion软件版本，其提供了一种计算RNA质量指数(RQI)的算法。RIN和RQI是基于从1到10的编号系统，其中1是降解程度最高的RNA谱(RNA profile)，而10是最完整的RNA谱。

然而，所有上述评估RNA完整性的手段仅提供了顺序尺度(ordinal scale)的测量：虽然它们可以将不同样品的完整性相对于彼此或外部标准进行排列，但是它们提供的是定性测量而不是真正的定量测量。它们提供的数值或评估可能足够指示样品中RNA的完整性是否足以允许其进一步分析，但是它们的作用也极大地限制于此目的。需要一种在比率尺度(ratio scale)上测量RNA完整性的方法，即真正的定量方法，其涉及RNA的结构并且能够将对目的RNA分子的测量与对RNA降解的测量结合起来以产生对目的RNA分子总数的定量测量。迄今为止，还没有实现这一点的手段。

在本发明的先导工作中，已开发了一种用于对RNA样品完整性程度进行定量的方法。更具体地，根据核苷酸受损的概率来定量样品中RNA的完整性。该定量信息可独立使用，以及用于根据降解程度校正随后得到的RNA表达结果。