[发明专利]双阿司匹林交联聚乙二醇化血红蛋白

说明书

发明领域

本发明大体上涉及用于在微血管系统中与天然血红蛋白相比以提高的速率将亚硝酸盐还原为氧化氮的交联聚乙二醇化血红蛋白和血红蛋白组合物。具体地说，本发明是针对使用具有提高的亚硝酸盐还原酶活性并且还可以将氧、一氧化碳、氧化氮或其混合物递送到组织中的高氧亲和力分子内交联聚乙二醇化血红蛋白缀合物。

发明背景

基于血红蛋白的氧载体(“HBOC”)一直被与血管收缩相联系，所述血管收缩已被归因于血红素对氧化氮(NO)的清除作用。适合作为氧治疗剂的氧载体(有时称为“携带氧的血浆容量扩张剂”)(诸如稳定化血红蛋白(Hb))已显示具有有限的功效，因为其清除氧化氮，从而引起血管收缩和高血压。这些携带氧的解决方案引起血管收缩的倾向可在动物和人类中显现为高血压。尽管HBOC的血管收缩作用的潜在机制尚未充分了解，但已表明血红素铁可快速并且不可逆地与内源性NO(一种强大的血管扩张剂)组合，从而引起血管收缩。

部分因为这些血管收缩作用，迄今为止尚无氧载体作为氧治疗剂(OTA)完全成功，不过包含修饰型无细胞Hb的产品已成为最有前景的产品。美国军队研发了用双二溴水杨基-富马酸酯的α链间交联的人Hb(ααHb)作为原型红细胞替代物，但在其展现肺及全身血管阻力剧烈增加之后被放弃(Hess，J.等，1991，Blood 78：356A)。此产品的商业形式在令人失望的III期临床试验之后也被放弃(Winslow，R.M.，2000，Vox Sang 79：1-20)。

已提出两种分子途径，试图克服Hb的NO结合活性。第一种途径使用远端血红素口袋的定位诱变，以求形成NO结合亲和力降低的重组血红蛋白(Eich，R.F.等，1996，35：6976-83)。第二种途径使用化学修饰途径，其中通过寡聚化增加Hb的大小，以求降低或有可能完全抑制Hb从血管间隔中溢出进入胞间隙(Hess，J.R.等，1978，J.Appl.Physiol.74：1769-78；Muldoon，S.M.等，1996，J.Lab.Clin.Med.128：579-83；Macdonald，V.W.等，1994，Biotechnology 22：565-75；Furchgott，R.，1984，Ann.Rev.Pharmacol.24：175-97；以及Kilbourne，R.等，1994，Biochem.Biophys.Res.Commun.199：155-62)。

事实上，已产生对NO的关联结合速率降低的重组Hb，其在最大负荷大鼠实验中更少产生高血压(Doherty，D.H.等1998，Nature Biotechnology 16：672-676以及Lemon，D.D.等1996，Biotech 24：378)。然而，研究表明NO结合可能不是Hb的血管活性的唯一解释。已发现某些大Hb分子(诸如用聚乙二醇(PEG)修饰的大Hb分子)实际上无血管收缩，尽管其NO缔合速率与严重高血压ααHb的NO缔合速率目同(Rohlfs，R.J.等1998，J Biol.Chem.273：12128-12134)。此外，发现当在出血之前作为交换输血提供时PEG-Hb预防出血结果格外有效(Winslow，R.M.等1998，J.Appl.Physiol.85：993-1003)。

PEG缀合至Hb使其抗原性降低并且延长其循环半衰期。然而，已报导PEG缀合反应引起Hb四聚体解离成αβ-二聚体亚基，从而在接受低于40，000道尔顿(“Da”)的Hb单体单元的PEG-缀合物的交换输血大鼠中引起严重的血红蛋白尿(Iwashita和Ajisaka Organ-Directed Toxicity：Chem.Indicies Mech.，Proc.Symp.，Brown等1981，编著Pergamon，Oxford，England第97-101页)。分子量大于84，000道尔顿的聚环氧烷(“PAO”)缀合Hb是由Enzon，Inc.(美国专利号5，650，388)制备，其携带约10个拷贝的在α和ε氨基处键联至Hb的PEG-5,000链。此取代度描述为避免在哺乳动物中与血红蛋白尿有关的临床上显著的肾毒性。然而，缀合反应产生异质缀合群体并且含有其它不合需要的反应物，其必须通过柱色谱法去除。