[发明专利]一种用于过滤生物样品的方法

说明书

一种用于过滤样品的方法，包含下列步骤：(a)提供带有真核细胞并含有或怀疑含有微生物的样品；(b)进行真核细胞的选择性裂解来获得裂解的样品；(c)使步骤(b)中获得的裂解的样品过滤通过设置成保留微生物的过滤器；(d)通过使基于洗涤剂的清洗缓冲液通过过滤器用基于洗涤剂的清洗缓冲液清洗过滤器来选择性地溶解源于由过滤器保留的真核细胞的蛋白质，从过滤器来移除蛋白质阻塞物，以允许另外的过滤所述裂解的样品的步骤(c)。

技术领域

本发明以一般的方式涉及在含有大量的其他细胞的样品中的低浓度微生物的检测，以及更特别地涉及在血细胞的选择性裂解之后血液样品的过滤的方法，来选择性地在过滤器上保留病原体，而移除血细胞物质，诸如DNA和蛋白质。

背景技术

分子诊断旨在快速检测样品诸如血液中微量的病原体(通常是细菌)。然而，血液是复杂的基质，以及包含用于适应性免疫系统的白血细胞(白细胞)、用于氧气传输的红血细胞(红细胞)、以及用于伤口愈合的血小板(platelets)(血小板(thrombocytes))。这种组成使得样品诸如全血中病原体的直接检测复杂化，全血含有高量的细胞物质，诸如DNA和蛋白质。

因此，需要用于从血液样品中富集病原体同时移除血液细胞物质的方法。

在已知的方法中，在血细胞的选择性裂解之后，通过大体积血液样品的过滤，病原体被收集在过滤器上。

在过滤步骤中，当病原体被保留在过滤器上时，抑制成分诸如DNA或蛋白质被移除。

国际专利申请WO-A-2011/070507公开了用于在含有或怀疑含有微生物的样品中真核细胞的选择性裂解的方法，其中洗涤剂和缓冲液被加入到所述样品来获得溶液，其进一步被孵育足够长的时间段来裂解真核细胞。这种方法允许具有5至10ml量级的体积的血液样品的处理，通过裂解样品中的白血细胞和红血细胞，降解白血细胞DNA，而微生物的主要部分(即多于20％、40％、60％、80％、90％，或甚至多于95％)依然活着，或如果通过处理被杀死，在细胞壁中仍然包含细菌DNA。所述微生物随后通过过滤步骤能够被富集，以便抑制成分诸如DNA或蛋白质被移除，而在细胞壁中带有它们的细菌DNA的病原体保留在过滤器上。

发明内容

所有可用体积的样品被过滤来收集最多的微生物在过滤器上是很重要的。然而，当该方法被应用时，在样品完全过滤之前，过滤器通常由于，例如，样品中也被保留在过滤器上的蛋白质的存在而被阻塞(clog)。这种阻塞导致过滤的失败，从而停止了整个处理。因此，现有的方法确实限制了在过滤器上能够被处理的样品的量。

本发明旨在解决这些上述缺点，以及首次提出了用于过滤带有真核细胞的样品的方法，没有限制能够被过滤的样品的体积的风险，以便与现有方法相比增加该方法的灵敏度。这样的过滤方法可被用于在含有高背景的蛋白质和/或核酸的复杂样品中检测微生物的一般方法。

为了这个目标，本发明的第一方面是用于过滤样品的方法，包含下列步骤：

(a)提供带有真核细胞并含有或怀疑含有微生物的样品；

(b)进行真核细胞的选择性裂解来获得裂解的样品；

(c)使步骤(b)中获得的裂解的样品过滤通过设置成保留微生物的过滤器；

(d)通过使基于洗涤剂的清洗缓冲液通过过滤器用基于洗涤剂的清洗缓冲液清洗过滤器来选择性地溶解过滤器上保留的除了微生物之外的物质，从过滤器移除由除了微生物之外的物质组成的阻塞物，以允许另外的过滤所述裂解的样品的步骤(c)；

(e)重复步骤(c)至少1次。