[发明专利]使用组合的核酸酶、连接和聚合酶反应用于核酸序列的相对定量、表达或拷贝变化的方法

说明书

本申请要求2012年2月14日提交的美国临时专利申请序列号 61/598,343、2012年2月29日提交的61/605,057和2012年5月8日 提交的61/644,405的权益，所述美国临时专利申请的全部内容通过引 用并入本文。

发明领域

本发明涉及使用组合的核酸酶、连接和聚合酶反应用于核酸序列 的相对定量、表达或拷贝变化的方法。

发明背景

基于连接的核酸检测反应通常采用与互补核酸靶标退火的两个 或多个基于核酸的寡核苷酸。这些寡核苷酸彼此直接邻接，并采用连 接酶通过连接一个寡核苷酸的5’-磷酸与直接邻接的寡核苷酸的 3’-OH来产生切口间的磷酸二酯键。所述连接测定通常是多重的。然 而，尤其是在多重反应中在第三个寡核苷酸上具有两个寡核苷酸连接 的非特异性连接可产生不希望的假阳性结果。此外，由于多种原因， 多重聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(ligation chain reaction, LCR)和连接酶检测反应(ligation detection reaction,LDR)/PCR方法受 可组合的引物数量限制，这些原因包括：(i)寡核苷酸和靶标组合形成 “引物-二聚体”脱靶型复合物的倾向，(ii)来源于使用具有固有不同退 火偏好和不同靶标特异性的引物序列的扩增的PCR扩增偏好，(iii) 对于LCR和LDR/PCR，大量的5’磷酸基团产生高背景的不期望的连 接和随后假扩增产物，和(iv)多重靶标数目增加时与比例缩放的扩增 反应相关的生物化学、信息学和原材料成本问题。

为了提高以便宜且可靠的方式特异性扩增单个或多个核酸靶标 的能力，需要配置除了传统单一/多重PCR或LCR之外的方法。能够 可靠地检测用于单重和多重用途的低频突变(例如，在10⁴正常背景下 单个突变分子(检测具有类似序列的0.01％DNA的信号的特异性)将 具有巨大价值，尤其是在诊断领域。实现该特异性可能够检测具有低 /极少量的肿瘤DNA样本中的癌症标记，例如，含有循环肿瘤细胞和 来自肿瘤细胞的无细胞DNA的样本。需要完成该检测的简单、特异 性并便宜的测定，但并不存在。

本发明针对克服现有技术中的这些及其它缺点。

发明概要

本发明的第一方面涉及用于鉴定样本中一个或多个靶核苷酸序 列的存在的方法。此方法包括提供可能含有所述一个或多个靶核苷酸 序列的样本并提供一个或多个寡核苷酸探针组。每个探针组包含(a) 具有靶特异性部分的第一寡核苷酸探针，和(b)具有靶特异性部分的 第二寡核苷酸探针。探针组的第一和第二寡核苷酸探针被配置为在靶 核苷酸序列上彼此相邻杂交，在第一和第二寡核苷酸探针之间形成接 合，并且在探针组中，第二寡核苷酸探针的靶特异性部分在接合处具 有与第一寡核苷酸探针重叠的相同核苷酸。该方法还包括在使探针组 的第一和第二寡核苷酸探针在相邻位置上以碱基特异性方式与其相 应的靶核苷酸序列(如果存在于样本中)杂交有效的条件下，使样本和 一个或多个寡核苷酸探针组接触，其中杂交后，在包含重叠的相同核 苷酸的接合处第二寡核苷酸探针的重叠的相同核苷酸形成侧翼 (flap)。用具有5’核酸酶活性的酶切割第二寡核苷酸探针的重叠的相 同核苷酸，从而释放在第二寡核苷酸探针的5’末端的磷酸，并且探针 组的第一和第二寡核苷酸探针在接合处连接在一起以形成连接的产 物序列。检测样本中连接的产物序列，并且基于该检测鉴定样本中一 个或多个靶核苷酸序列的存在。