[发明专利]表现出外位点介导的超级活性的FVIIa-sTF复合物

说明书

发明领域

本发明涉及凝血因子VIIa多肽和组织因子多肽的促凝复合物。

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序列表为10.878字节，在2012年3月22日创建并通过引用并入本文。

背景

在具有凝血病的主体中，诸如在具有血友病的个体中，凝血级联的各个步骤由于例如凝血因子的不存在或不足的存在而致使功能障碍。凝血级联的一部分的此类功能障碍导致不足的血液凝固和可能的威胁生命的出血，或对于内部器官诸如关节的损害。具有A和B型血友病的个体可以接受凝血因子替代治疗诸如分别接受外源因子VIII(FVIII)或因子IX(FIX)。具有A和B型血友病的个体可能发展分别针对FVIII或FIX的抑制剂(抗体)，在这种情况下，使用旁路剂(bypassing agents)诸如外源因子VIIa(FVIIa)进行治疗可能有必要。

因子VII(FVII)是主要在肝脏中产生的糖蛋白。成熟蛋白由406个氨基酸残基组成，并且由如通过同源性限定的四个结构域组成。存在N末端Gla结构域，随后为两个表皮生长因子((EGF)-样)结构域和C末端丝氨酸蛋白酶结构域。FVII在血浆中作为单链分子循环。在活化为活化的FVII(FVIIa)后，分子在残基Arg152和Ile153之间切割，导致通过二硫键结合在一起的二链蛋白。轻链含有Gla和EGF样结构域，而重链是蛋白酶结构域。FVIIa要求与其辅因子组织因子(TF)结合，以获得完整的生物学活性。

TF是位于血管外膜细胞上的263个氨基酸的完整膜糖蛋白受体。其由折叠成两个各被单一二硫键稳定化的紧凑III型纤连蛋白-样结构域(1-219)的细胞外部分、一个跨膜区段(220-242)和一个短细胞质尾(243-263)组成。它通过与FVII形成在血管损伤后可从循环中被捕获的紧密 Ca²⁺依赖复合物而充当凝血的关键引发剂。TF通过充当分子支架、通过为其生理学底物提供需要的外位点(exosite)相互作用和通过诱导导致蛋白酶的活性位点区域的成熟的FVIIa的蛋白酶结构域中的构象变化而大大增加FVIIa对其生理学底物因子IX和因子X的蛋白水解活性。由直接蛋白-蛋白相互作用引起的TF对FVIIa的活化可在体外通过用TF的可溶性外结构域诸如sTF(1-219)饱和FVIIa而进行模拟。

EP2007417B1公开了包含FVIIa多肽和可溶性TF多肽的复合物。已经显示这些复合物在磷脂膜上表现出非常高的蛋白水解活性，但这种有利特征伴随着在溶液中的高蛋白水解活性和对小肽底物的高酰胺水解活性，以及循环血浆抑制剂诸如抗凝血酶III(ATIII)的快速抑制。在体内环境中，此类复合物可被迅速失活，导致短药代动力学曲线。

因此，存在对于以下包含FVIIa多肽和可溶性TF多肽的复合物的需要，所述复合物在膜表面上表现出高蛋白水解活性以及在溶液中降低的酰胺分解活性和降低的蛋白水解活性的期望特性。此类复合物是，优选地，最小免疫原性的。

概述

本发明涉及二硫键连接的(i)包含用Cys取代氨基酸残基Gln64和用另一个天然存在的氨基酸残基取代氨基酸残基Met306的SEQ ID NO:1的FVIIa变体和(ii)包含用Cys取代氨基酸残基Gly109的SEQ ID NO:3的可溶性组织因子(sTF)变体的复合物。FVIIa变体多肽可以进一步包含氨基酸残基Asp309的取代。本发明还涉及包含二硫键连接的复合物的核酸分子和表达二硫化物复合物的细胞。

一种制备本发明的二硫键连接的复合物的方法，包括：(i) 在哺乳动物细胞中产生包含用Cys取代氨基酸残基Gln64和用另一个天然存在的氨基酸残基取代氨基酸残基Met306的SEQ ID NO:1的因子VIIa变体；(ii) 在原核或真核细胞中产生包含用Cys取代氨基酸残基Gly109的SEQ ID NO:3的可溶性组织因子变体；(iii) 用其中官能团之一是半胱氨酸反应性的异双官能试剂标记Cys；和(iv) 借助所述异双官能试剂的第二个官能团将所述可溶性组织因子变体交联至因子VIIa变体。

根据本发明的二硫键连接的复合物可以用作药物，特别是用于治疗凝血障碍。

附图简述