[发明专利]间充质干细胞的培养

说明书

技术领域和背景技术

本发明在其一些实施方案中涉及扩增间充质干细胞和由其产生的细胞群的方法。

间充质干细胞(MSCs)是非造血细胞，其能够分化成特定类型的间充质或结缔组织，包括脂肪、骨、软骨、弹性、神经元、肝脏、胰腺，肌肉和纤维结缔组织。这些细胞进入的特定分化途径取决于来自机械影响和/或内源性生物活性因子(例如生长因子、细胞因子和/或由宿主组织建立的局部微环境条件)的各种影响。

MSC在整个成年生物体中位于不同的组织宿主中并且具有使对于这些组织为特异性的细胞类型“再生”的能力。这些组织的实例包括脂肪组织、脐带血、骨膜、滑膜、肌肉、真皮、周细胞、血、骨髓和海绵骨。

间充质干细胞的多能性特征使得这些细胞成为有吸引力的治疗手段和用于移植的候选物，并能够在细胞和基因疗法策略背景下的广泛临床应用中发挥作用。可将间充质细胞用于增强移植后的造血植入、修正骨和软骨的遗传性和获得性障碍、假肢器官装置至结缔和骨骼组织的植入以及用作基因疗法的媒介物。

在培养中，扩增的MSC表达一组关键标志物，包括CD105(内皮因子、SH2)、CD73(外－5’核苷酸酶、SH3、SH4)、CD166(ALCAM)、CD29(β1-整联蛋白)、CD44(H-CAM)和CD90(Thy-1)。与造血干细胞相反，它们缺乏CD45、CD34和CD133的表达。

MSC可通过它们在体外形成成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)的能力来鉴定。然而，这些细胞在其增殖和分化能力方面是异质性的。已鉴定了至少两个形态学上不同的MSC群，其不仅在大小上还在其细胞分裂率和分化能力上不同。此外，来自成人骨髓的源自单细胞的MSC集落的分析显示集落经历成骨性、脂肪形成和软骨形成分化的不同能力。

在大多数情况下，未分级的骨髓衍生细胞被用作培养MSC的起始群体。该分离法依赖于成纤维细胞样细胞至塑料表面的粘附和非粘附造血细胞的去除。所产生的细胞不好界定，并且不仅产生异质性MSC群还产生成骨细胞和/或骨祖细胞、脂肪细胞、网状细胞、巨噬细胞和内皮细胞。为了更准确地界定起始群体，已使用了MSC中富集的表面标志物，例如SH2(CD105)、SH3/SH4(CD73)、SSEA-4和低亲和力神经生长因子受体(CD271)(Simmons P.J等人，(1991)Blood 78:55–62；Conconi MT等人,(2006)Int J Mol Med 18:1089–96；Gang EJ等人,(2007)Blood 109:1743–51；Liu PG,(2005)；Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 13:656–9；Quirici N等人,(2002)Exp.Hematol 30:783–91)。

另一个靶向分离间充质干细胞的均质群体的细胞表面抗原的实例是间充质前体抗原－1(STRO-1)。STRO-1抗原在约10－20％的成人BM(包括所有的CFU-F、血型糖蛋白A有核红细胞以及CD19B细胞的一小亚类)上表达，但其不在造血干细胞和祖细胞(HSC)上表达(Simmons and Torok-Storb,1991)。STRO-1被广泛地认为是早期间充质/基质前体细胞的标志物，因为其与间充质细胞集落生成、可塑性和其它祖细胞特征强烈相关(Psaltis等人,(2010),Journal of Cellular Physiology,530-540)。已显示STRO-1(STRO-1Bright)与其它表面标志物例如CD106、CD49a、CD146或STRO-3的高共表达极大地增加了BM MNC的克隆形成率(Gronthos等人,2008,Methods Molecular Biology,449:45-57)。新分离的STRO-1^Bright BM MNC还具有其它的多能干细胞所特有的标志性特征，包括体内静态、高端粒酶活性和未分化表型。此外，该细胞群缺乏造血干细胞相关(CD34)、白细胞相关(CD45)和红细胞相关(血型糖蛋白－A)的标志物。

最近，血小板衍生生长因子受体-β(PDGF-RB；CD140b)被鉴定为克隆生成MSC的分离的选择性标志物(Buhring HJ,(2007)Ann N Y Acad Sci1106:262–71)。其它的报道证明MSC在具有显著的醛脱氢酶活性的骨髓细胞中有9.5倍的富集(Gentry T et al.,(2007)Cytotherapy 9:259–74)。