[发明专利]具有叶中较低硝酸盐含量的转基因植物

说明书

技术领域

本发明涉及可以用于制备转基因植物的遗传构建体。构建体可以具有降低植物特别是植物的叶中硝酸盐浓度的能力。本发明扩展至用此类构建体转化的植物细胞和转基因植物本身。本发明还涉及产生转基因植物的方法和在植物中降低硝酸盐含量的方法。本发明还提供用于改变植物氨基酸概况的方法。本发明还涉及已用遗传构建体转化的收获的植物叶(例如烟草叶)和包含此类收获的植物叶的各种烟草制品(诸如吸烟制品)。

背景

氮同化对于植物生长具有根本重要性。在植物所需的所有矿物质营养物中，氮是最大丰度需要的。在田间植物摄取的氮的主要形式是硝酸盐和氨，其是氮肥的主要组分。根据可用性，植物从土壤中摄取硝酸盐或铵离子。硝酸盐在充分氧化的非酸性土壤中会更丰富，而铵会在酸性或积水土壤中占优势。对烟草生长参数的实验清楚地表明，相对生长速率、叶绿素含量、叶面积和根面积响应于渐增的硝酸盐供应而急剧增加。

植物已经发展了高效氮摄取系统以处理耕种土壤的硝酸盐含量的巨大变化。植物根通过特定硝酸盐转运蛋白(NTR)的作用摄取硝酸盐和氨，所述硝酸盐转运蛋白(NTR)被分为两个基因家族，NRT1基因家族和NRT2基因家族。两个基因家族共存于植物中，并且它们被认为协作作用，以便从土壤中摄取硝酸盐，以协助将其分布到整个植物中发现的细胞。然而，一旦在细胞内，关于用于将硝酸盐转运至不同的细胞区室的机制知之甚少。

进入细胞后，据信，硝酸盐在液泡中积累，导致高达50 mM的浓度，这比细胞质内发现的硝酸盐浓度高25倍。液泡硝酸盐有助于维持胞质硝酸盐的稳态。AtCLC-a(阴离子/质子交换蛋白)，其属于拟南芥CLC蛋白家族，已经显示其在液泡硝酸盐转运中发挥作用。AtCLC-a是已知的硝酸盐-质子交换蛋白，并且负责将硝酸盐装填至液泡中。拟南芥中AtCLC-a的敲除导致其硝酸盐积累能力相比于野生型植物降低50％。这表明存在也可以负责将硝酸盐装填至植物液泡中的额外基因。

已经在拟南芥中鉴定了七种CLC蛋白家族的同源物，并且它们被称为AtCLC-a至AtCLC-g。基于序列同一性，AtCLC-a、-b、-c、-d和-g各自定义与哺乳动物CLCs的亚家族具有最高同源性的单独的系统发生分支。AtCLCs在植物中广泛表达。然而，这些蛋白的功能作用远远没有被理解。

除了AtCLC-a以外，据信AtCLC-c是植物中硝酸盐积累途径的主要组分。拟南芥植物的枝芽，其含有AtCLC-c的转座子插入，具有相比于野生型植物的根部较低的硝酸盐浓度。然而，不像AtCLC-a突变体，AtCLC-c突变体的根部也具有相比于野生型植物改变的氯化物浓度，这表明AtCLC-c表现出比AtCLC-a更低的阴离子特异性。此外，AtCLC-d，其在植物细胞的反式高尔基体网络中表达，并且与V型ATP酶共定位，据信在植物根部的发育中发挥作用。以下发现支持这一点：拟南芥植物中的无功能的AtClC-d突变体的T-DNA插入损害根部生长，对氯离子含量、硝酸盐含量或细胞形态具有很少或没有影响。

一旦在细胞中，硝酸盐在细胞溶胶中被胞质酶硝酸盐还原酶(NR)还原为亚硝酸盐。然后新形成的亚硝酸盐被转运到叶绿体中，并被亚硝酸还原酶(NiR)迅速还原为铵。然后铵进入谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶循环(GS/GOGAT)，在那里它被并入氨基酸库中。亚硝酸盐从细胞溶胶转运到叶绿体中的机制是未知的。已经假设，被动扩散可能负责其进入叶绿体中，并且这可以部分地由于在叶绿体的表面上表达的转运蛋白的存在，诸如：(i) CsNitr1 (黄瓜(Cucumis sativus)亚硝酸盐转运蛋白) – 已经在黄瓜叶绿体外被的内膜上鉴定的硝酸盐转运蛋白；(ii) At1g68570 – CsNitr1的直向同源物。拟南芥中At1g68570多肽的非功能形式的过表达引起转基因植物中相比于野生型植物中亚硝酸盐的过度积累；和(iii) AtCLC-e - 叶绿体内类囊体膜的表面上表达的拟南芥CLC蛋白家族成员。从拟南芥植物敲除clc-e导致相比于野生型植物细胞的硝酸盐积累的降低和转基因拟南芥植物内亚硝酸盐积累的增加。

然而，拟南芥的细胞溶胶内亚硝酸盐的相对低浓度使得被动扩散不太可能是负责亚硝酸盐进入叶绿体的机制。此外，难以得出是否AtCLC-e实际上在调节细胞内硝酸盐流量中发挥作用的结论，因为从拟南芥敲除AtCLC-e也影响还牵涉细胞内硝酸盐水平的调节的几个其它基因的表达。