[发明专利]用于减少非特异性核酸扩增的方法和试剂盒

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求保护提交于2012年4月13日的美国专利申请第13/446,474号的优先权，该专利申请要求提交于2012年2月15日的美国临时申请第61/599,119号的权益，所述临时申请通过全文引用并入此处。

发明领域

本公开主要涉及用于扩增所关心的靶核酸的方法和试剂盒。在这里描述的方法和组合物通过使用新引物促进所需靶核酸的扩增，从而减少不需要的扩增产物（如，引物二聚体和嵌合核酸）的产生。

发明背景

多种技术目前可以用于甚至从起始核酸模板的数个分子有效扩增核酸。这些包括聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、自持序列复制（3SR）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、链置换扩增（SDA）、多重置换扩增（MDA）和滚环扩增（RCA）。这些技术很多涉及对起始核酸模板的指数扩增并能够快速地产生大量的扩增产物。用于靶核酸的扩增的试剂盒可市购（例如，GenomiPhi?（General Electric, Inc）和RepliG?（Qiagen, Inc.），但对于这些方法的改进会是有利的。

核酸扩增技术常常应用于基于核酸的测定，其用于分析物的探测、传感、法医和诊断应用、基因组测序、全基因组扩增等。这类应用常常要求扩增技术具有高特异性、灵敏性、准确性和稳健性。但是，当前可用于核酸扩增的技术大多数受到高背景信号的妨害，这些高背景信号由产生不需要的扩增产物的非特异性扩增反应产生。这些非特异性扩增反应妨碍了很多这些技术在重要的基于核酸的测定中的有效应用。例如，传统扩增反应的应用可产生假阳性结果，从而导致不正确的诊断。这种非特异性的背景扩增反应在仅痕量的待扩增靶核酸可用（例如，从单一的DNA分子中扩增全基因组）时变得甚至更成问题。

非特异性背景扩增反应可归因于例如样品中污染核酸序列的扩增，引物二聚体的形成，或嵌合核酸的产生（例如，产生于所需核酸产物的自杂交）。在核酸扩增反应中非特异性扩增的常见来源产生于多种不希望有的引物相互作用。引物可与靶核酸中的核酸区域杂交，或与同靶核酸的一部分具有共享某种同源性的污染核酸中的核酸区域杂交。如果引物的3'末端对于非靶定区域具有足够的同源性，这一区域可被扩增。

非特性扩增也可产生于计划外的核酸模板不依赖性的引物-引物相互作用。引物可通过链内或链间引物退火（例如，分子内或分子间的杂交）形成引物二聚体结构，导致不需要的核酸的扩增。所产生的假引物延伸产物可进一步被扩增且有时可支配、抑制或掩弊所需的靶序列扩增。此外，扩增产物可自杂交，在扩增反应过程中允许核酸聚合酶产生杂交产物或嵌合产物。

为引发DNA合成，目前MDA配方常常利用带有序列5'-NNNNN*N的随机六聚体，其中“N”表示脱氧腺苷（dA）、脱氧胞苷（dC）、脱氧鸟苷（dG）或脱氧胸苷（dT），“*”表示硫代磷酸酯键。

不能通过分子内或分子间杂交作用交叉杂交的受限型随机化六聚体引物（例如，R₆，其中R=A/G）已用于在核酸扩增过程中抑制引物二聚体结构的形成。但是，这些受限型随机化引物在核酸扩增反应中给予了相当大的偏倚。这类引物对于序列非特异性或序列非偏倚性核酸扩增反应（例如，全基因组或未知核酸序列扩增）也具有有限的应用。

为引发DNA合成，MDA配方常常利用带有如下序列的随机六聚体：5'-NNNNN*N，其中“N”表示脱氧腺苷（dA），脱氧胞苷（dC），脱氧鸟苷（dG）或脱氧胸苷（dT），“*”表示硫代磷酸酯键。使竞争性非靶核酸（即，模板DNA）扩增最小化的一种解决方案是以使得抑制它们彼此退火的能力的方式修饰寡核苷酸引物。

用于克服与使用上述随机六聚体引物的核酸扩增相关的问题的以前的研究包括在美国专利第7,993,839号（2011年8月9日授予）中公开的那些方法和试剂盒。此专利中描述的技术包括但不限于如下通用结构的六聚体引物的使用：5'-+W+WNNN*S-3'，其中“＋”在锁定核苷酸碱基之前（即，“LNA碱基”；例如，+A=腺苷LNA分子），“W”表示仅dA和dT的混合物，“S”表示仅dC和dG的混合物。所述“*”表示两个核苷酸间的硫代磷酸酯键。由于“W”碱基不能与“S”碱基稳定地配对，抑制了寡核苷酸双链体的形成，这导致非模板核酸的扩增减少。这些方法和试剂盒可称为“SD GenomiPhi”。