[发明专利]用于减少非特异性核酸扩增的方法和试剂盒

权利要求书

1. 用于扩增核酸的方法，包括：

a）提供核酸模板；

b）使核酸模板与包含DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和具有3'末端和5'末端的引物的反应溶液接触，其中所述引物包含：（i）提高引物的解链温度（T_m）的核苷酸类似物和（ii）防止引物二聚体形成的核苷酸类似物；以及

c）扩增所述核酸模板。

2. 权利要求1的方法，其中扩增所述核酸模板在等温条件下实施。

3. 权利要求1的方法，其中扩增所述核酸模板在高严格条件下实施。

4. 权利要求1的方法，其中所述DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶。

5. 权利要求1的方法，其中所述引物为随机引物。

6. 权利要求1的方法，其中所述引物为硫代酯化的(thioated)。

7. 权利要求1的方法，其中所述引物中的一种核苷酸类似物是在核苷酸碱基之前的锁定核酸（LNA），其中在所述引物中所述LNA核苷酸碱基的并入提高引物的T_m。

8. 权利要求7的方法，其中所述LNA核苷酸碱基不位于该引物的 3'末端。

9. 权利要求1的方法，其中所述引物中的一种核苷酸类似物为2-氨基-脱氧腺苷（2-氨基-dA），其中2-氨基-dA的并入提高所述引物的T_m。

10. 权利要求9的方法，其中所述引物进一步包含核苷酸类似物2-硫代-脱氧胸苷（2-硫代-dT），其中在所述引物中核苷酸类似物2-氨基-dA和核苷酸类似物2-硫代-dT的并入防止引物二聚体的形成。

11. 权利要求10的方法，其中所述引物进一步包含在核苷酸碱基之前的LNA。

12. 权利要求1的方法，其中所述引物是六聚体。

13. 权利要求12的方法，其中所述六聚体具有如下通用结构：(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*N，其中(atN)是六聚体的5'末端核苷酸，*N是六聚体的3'末端核苷酸，以及其中“N”表示脱氧腺苷（dA）、脱氧胞苷（dC）、脱氧鸟苷（dG）或脱氧胸苷（dT），“+”表示在核苷酸碱基之前的LNA，(atN)表示2-氨基-dA、dC、dG和2-硫代-dT的随机混合物，“*”表示硫代磷酸酯键。

14. 权利要求1的方法，其中扩增所述核酸模板包括滚环扩增（RCA）或多重置换扩增（MDA）。

15. 权利要求1的方法，其中所述方法允许痕量核酸的扩增。

16. 用于扩增核酸的试剂盒，包括：

（a）DNA聚合酶；

（b）脱氧核糖核苷三磷酸;以及

（c）具有3'末端和5'末端的引物，其包含：（i）提高引物的解链温度（T_m）的核苷酸类似物和（ii）防止引物二聚体形成的核苷酸类似物。

17. 权利要求16的试剂盒，其中所述DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶。

18. 权利要求16的试剂盒，其中所述引物为六聚体。

19. 权利要求18的试剂盒，其中所述六聚体具有如下通用结构：(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*N，其中所述六聚体的5'末端是(atN)，所述六聚体的3'末端是*N，“N”表示dA、dC、dG或dT，其中(atN)表示2-氨基-dA、dC、dG和2-硫代-dT的随机混合物，“*表示硫代磷酸酯键。

20. 权利要求18的试剂盒，其中所述引物包含核苷酸类似物2-氨基-dA和核苷酸类似物2-硫代-dT。