[发明专利]用于调节基因表达的寡核苷酸及其用途

说明书

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本发明涉及用于调节基因表达的寡核苷酸，特别是用于调节负责遗传、肿瘤或病毒来源的病状的基因。

此外，本发明涉及所述寡核苷酸用于所述疾病的治疗和/或诊断的用途，所述寡核苷酸可能是化学修饰的。

寡核苷酸是天然RNA或DNA核酸或合成核酸的短序列，例如，PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)和吗啉代寡核苷酸。

已经通过实验证明了寡核苷酸在转录和翻译水平上调节基因的表达中是非常有效的。由于这种能力，寡核苷酸代表了用于各种病状治疗的有效方法，特别是遗传、肿瘤或病毒来源的疾病。

调节基因的表达意味着可以将其抑制或激活。

例如，能够通过与基因的反义链形成互补键(Hélène C，Bioch Bioph Acta1990，1049(2):99-125)或改变目标基因调控区中的染色质状况(Rossi JJ，Nat Chem Biol2007，3(3):136-7)来抑制基因转录的寡核苷酸是已知的。其他寡核苷酸能够抑制基因翻译，例如，通过与靶标信使RNA(mRNA)的互补键。在单链寡核苷酸的情况中，这种键通过RNase H复合物引起mRNA的酶降解。在其中寡核苷酸是双链“干扰”RNA分子的情况中，寡核苷酸与靶标mRNA的互补键通过RISC复合物的“沉默子”酶，引起信使的降解。在后一种情况中，寡核苷酸还可以是等于内源性microRNA的寡核苷酸，其依靠不完全的互补性，能够与靶标mRNA的3’UTR(3’未翻译区)相连，引起mRNA的翻译被阻断。

寡核苷酸还可以诱导基因的激活或其转录的提高，例如，经由与长的反义非编码RNA的互补键(Morris KV，Epigenetics，2009，4(5):296-301)，或通过抑制互补微RNA，结果是微RNA的靶标mRNA的翻译提高。

为了提高它们在治疗和/或诊断条件中的有效性，可以将寡核苷酸进行化学修饰。例如，可以为了提高其特异性和/或与互补序列配对的效力，对寡核苷酸进行修饰，或为了使其对酶降解不太敏感、提高其药物动力学/药效谱，或促进其通过细胞膜，对寡核苷酸进行修饰。

除了天然核酸的寡核苷酸(即，DNA和/或RNA的短序列)，还存在合成核酸的寡核苷酸，例如，肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA)，其已经得到了很大程度的研究和表征，以上全部的目的在于通过反基因策略来调节基因的表达(即，设计来直接冲击(strike)基因)。PNA和LNA寡核苷酸，与全部修饰的寡核苷酸一样，通常在化学上比DNA或RNA寡核苷酸更稳定。可以通过合成嵌合寡核苷酸进一步提高它们的稳定性。嵌合寡核苷酸例如是其中插入了传统单体(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)和合成核碱基(单体)(例如，LNA单体)两者的寡核苷酸序列。

将LNA与反义策略一起使用，通过抑制靶标基因的转录产物来沉默基因(Braasch DA，Nucl Acids Res，2002，30(23):5160-7)。或者，LNA寡核苷酸也可以用于反义策略中，如Smith和同事所做的(Ge R，Faseb J，2007，1902-14)，他们设计了以这样的方式能够通过“链入侵”机理在核酸的两条链上相互作用的寡核苷酸序列，使得形成“Z-型”结构(限定为“Zorro”寡核苷酸)。

与其他寡核苷酸结构相比时，PNA寡核苷酸对酶更稳定。PNA可以通过“链入侵”结合双链DNA(DNAds)，或可以以互补方式结合单链DNA(DNAss)的分子，或它们可以结合RNA链，产生杂合双螺旋PNA/DNA或PNA/RNA结构，其与“同质双链”结构(如，DNA/DNA双链)相比，在热力学上非常稳定。

PNA代表了用于调节基因表达的高度有利的系统，以上全部使用反基因策略。实际上，已经证明了PNA对靶标序列呈现出高特异性，并且因此能够以有效的方式抑制蛋白质的表达。

因此，PNA代表了用于遗传或病毒的疾病的有前景的治疗方法。

PNA的唯一缺陷是它们具有有限的穿过细胞膜的能力的事实。然而，可以通过通常将寡核苷酸(并且特别是PNA)与能够给予更有效地穿过细胞膜的分子(载体)结合解决了这一限制。

实际上，寡核苷酸，并且特别是PNA，通常可以使用与其结合的载体(或“标记物”)来给药，例如，具有1至30个氨基酸长度的肽序列。

寡核苷酸的一个特别应用是调节基因的表达，其在肿瘤中被激活或抑制。