[发明专利]半合成抗生素生产中的类MbtH蛋白

说明书

发明领域

本发明涉及制备β-内酰胺抗生素的方法，其中所述方法包括以下步骤：在类MbtH蛋白存在时，将4-羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸、半胱氨酸和缬氨酸与非核糖体肽合成酶接触，随后使用异青霉素N合成酶环化。本发明还涉及能够完成所述制备的宿主细胞。

发明背景

类MbtH蛋白是类似于来自Mycobacterium tuberculosis的MbtH的小蛋白。虽然最近的研究表明类MbtH蛋白在肽的生物合成中起作用(尤其是促进腺苷酰化反应)，但在很大程度上其功能仍是未知的。Heemstra等人(J.Amer.Chem.Soc.(2009)131，15317-15329)已报道了在类MbtH蛋白VbsG参与时，利用腺苷酰化功能域VbsS腺苷酰化N(5)-((R)-3-羟基丁酰基)-N(5)-羟基-D-鸟氨酸。同样地，Felnagle等人(Biochemistry(2010)49，8815-8817)已报道了分别利用腺苷酰化功能域EntF、CmnO/VioO和CmnA腺苷酰化L-丝氨酸、β-赖氨酸和L-2，3-氨基丙酸。对于L-丝氨酸的腺苷酰化，显示类MbtH蛋白YbdZ的参与；对于β-赖氨酸的腺苷酰化，显示类MbtH蛋白CmnN或VioN的参与，然而还发现CmnN参与L-2，3-氨基丙酸的腺苷酰化。此外，Zhang等人(Biochemistry(2010)49，9946-9947)展示了利用腺苷酰化功能域PacL腺苷酰化m-酪氨酸时，类MbtH蛋白KtzJ、PacJ和GlbE的参与；最后，Boll等人(J.Biol.Chem.(2011)286，36281-36290)证明了利用腺苷酰化功能域CloH、SimH或Pcza361.18腺苷酰化L-酪氨酸时，类MbtH蛋白Cloy、SimY和Orflvan的参与。

编码类MbtH蛋白的基因(类mbtH基因)往往发现于原核微生物的非核糖体肽合成酶(NRPS)基因簇中。GenBank中保藏了许多类mbtH基因。为了鉴定类MbtH蛋白，BLASTP研究展示了由放线菌门、厚壁菌门和变形菌门的成员编码的同系物，但是未发现由古生菌编码的同系物(R.H.Baltz，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.(2011)38，1747-1760)。没有真核生物中类mbtH基因的报道。

微生物产生的许多次级代谢产物都具有重要价值。在这方面重要的一类是β-内酰胺抗生素(尤其是青霉素类和头孢菌素类)。生物合成青霉素的第一步是将三个氨基酸的L-异构体(L-α-氨基己二酸(A)、L-半胱氨酸(C)和L-缬氨酸(V))缩合为一个三肽(δ-(L-α-氨基己二酰基)-L-半胱氨酰基-D-缬氨酸(ACV))。该步由δ-(L-α-氨基己二酰基)-L-半胱氨酰基-D-缬氨酸合成酶(ACVS)催化。在第二步，ACV在异青霉素N合成酶(IPNS)作用下被氧化环化。该步反应的产物是异青霉素N，通过将其亲水性的α-氨基己二酰基侧链置换为疏水性侧链可形成青霉素G或青霉素V。在工业生产中通常使用的侧链是产生青霉素G的苯乙酸或产生青霉素V的苯氧基乙酸。置换反应由酰基转移酶催化。尽管研究显示己二酸和己二酸的某些硫代衍生物能够被置换(WO95/04148和WO95/04149)，但由于酰基转移酶的底物特异性，几乎不可能将α-氨基己二酰基侧链置换为感兴趣的任意其它侧链。特别地，工业上重要的青霉素类和头孢菌素类的侧链不能通过酰基转移酶被直接置换。因此，目前使用的大部分β-内酰胺抗生素是通过半合成方法制备的。这些半合成的β-内酰胺抗生素是通过利用一个或多个化学反应和/或酶反应修饰N-取代β-内酰胺产物得到的。这些半合成方法的缺点在于步骤繁多、不环保而且成本高。因此，利用完全发酵方法生产β-内酰胺抗生素(例如羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、依比青霉素、头孢羟氨苄、头孢氨苄和头孢拉定)是相当令人期待的。