[发明专利]作为标记物用于预测骨折延迟愈合的CD8+T细胞亚群

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于预测和预防骨折延迟愈合的方法、系统和试剂盒。

背景技术

骨折愈合是具有连续的重叠阶段的生理过程，并导致骨组织的修复。然而由于某些风险因素，如严重骨折、高龄、类固醇治疗或糖尿病，这个过程会被延迟或甚至不完整(骨折不愈合)，带来差的长期疗效和高社会经济影响。在长骨骨折的患者中可以观察到约5-10％的患者愈合延迟或不完整。

在有关不良愈合背后的机制方面只有有限的认识。有越来越多的证据表明，炎症和T细胞应答在伤后骨修复过程中起到关键作用，其中T细胞应答影响如趋化性、导致刺激血管生成的其他免疫和间充质细胞的募集以及最终细胞外基质合成的增强的一系列过程(Schmidt-Bleek et al.,J Orthop Res.；27(9):1147-51；Kolar et al.,Tissue Eng Part B Rev.；16(4):427-34；Toben et al.J Bone Miner Res.,Jan；26(1):113-24)。

最近的数据显示，虽然矿化作用不如对照组有效，但缺乏适应性免疫的小鼠出人意料地表现出增强的骨愈合(Colburn et al.Arthritis Rheum.；60(6):1694-703；Schmidt-Bleek et al.Cell Tissue Res；DOI10.1007/s00441-011-1205-7)。此外，由于用具有高旋转不稳定性的机械临界外固定器(mechanically critical external fixator)进行处理，与严格固定的动物相比，在经历延迟/受损愈合的羊中发现血肿内细胞毒性T细胞百分比明显更高。

已对骨钙素和骨碱性磷酸酶作为预测标记物用于骨折延迟愈合进行了研究。然而，不早于骨折发生后42天内，只有骨钙素显示出了患者正常愈合和骨折延迟愈合之间的细微差别。此外，已讨论转化生长因子β1(TGF-β1)作为另一种潜在的生物标记物。检查显示，骨折4周后，骨折延迟愈合的患者的TGF-β1水平比显示正常愈合的患者的水平低。然而，由于高的内-间患者变异性(intra-inter patients variability)、细胞因子的短半衰期和在骨折愈合过程中迟的预测时间点，这些参数对骨愈合的预测仅具有有限的效度。

对于预测骨折后结果以尽可能早地实施支持疗法的生物标记物如生长因子如BMP(骨形态发生蛋白)有未满足的需求，这些生物标记物是昂贵的且并非没有副作用。

本发明的目的是提供用于预测延迟的骨折的装置和方法。

本发明是在评估在愈合过程中临床相关性的典型时间点上胫骨近端骨折患者的外周血中炎症反应和免疫细胞组成的研究过程中完成的。对在涉及延迟愈合的骨折愈合过程中外周血中免疫细胞组成的相关差异进行了鉴定。

总T细胞计数(CD3+)或主要亚群分布(CD3+4+和CD3+8+)没有表现出组(正常与延迟愈合)之间的差异。然而，令人惊奇地发现，延迟愈合与表达表型CD8+11a++28-和/或CD8+11a++57+和/或CD8+11a++CD28-57+的终末分化CD8+效应T细胞的显著提高的频率有很大关联，CD8+效应T细胞对应于在受伤/手术后不同的时间点上(<1周至>18周)的CD8+TEMRA细胞(CD57+8+延迟愈合相对于正常情况：1.6-1.8倍，CD28-8+延迟愈合相对于正常情况：1.5-1.6倍；CD11++8+延迟愈合相对于正常情况：1.2-1.3倍)。CD8+TEMRA细胞也表达了标记表型CCR7-CD45RA+CD45RO-。这种差异在18周的跟踪调查期间是稳定的，反映出对于骨折的个体免疫经历而非创伤后反应。

CD8+TEMRA细胞的特点在于其(炎症)组织返回性能(tissue homing property)和强大的旁观者反应(bystander responsiveness)。它们也可以通过细胞因子，如IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、IL-23或TNFα，独立于其T细胞受体(TCR)以抗原非依赖性方式触发。由于toll样受体分子(TLR)和损伤相关分子模式(DAMP)之间的相互作用，这些细胞因子通过在骨折血肿中触发的先天免疫系统的细胞传递。此外，巨噬细胞和树突状细胞可通过这些CD8+TEMRA细胞触发炎症细胞因子(如IFN-γ)的释放，这些细胞因子支持了压倒性的炎症和纤维变性，并抑制骨生成。此外，这些细胞在慢性免疫激活状态中，例如在感染性疾病，如HIV，结核病或巨细胞病毒疾病中被上调。