[发明专利]一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于表达载体构建领域，特别涉及一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法。

背景技术

MicroRNA是长度为21-25碱基单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。自从1993年第一个miRNA被报道以来，人们发现miRNAs几乎参与了所有重要的生物学过程的调控^[1]，miRNAs的异常表达与人类多种疾病相关^[2]。迄今为止，700多种已被鉴定出来的人源性miRNAs调控了人类1/3以上基因的表达。miR-505位于小鼠X染色体X:57647578-57647667处，ATP11C基因的第一和第二外显子之间的第一个内含子中，对于其生物学功能的研究目前还处于起步阶段。

2010年，Verduci L等发现miR-505能通过作用于其靶标ASF/SF2（可变剪接因子）发挥调控小鼠胚胎成纤维细胞的增殖和衰老/凋亡的作用^[3]，Karni R等发现在许多细胞中转染ASF/SF2可以激活mTOR部分信号通路^[4]，但是ASF参与调控mTOR的具体方式还不清楚。Yamamoto Y等在研究肿瘤多药抗性时，发现miR-505是一个新的肿瘤抑制miRNA，与其呈现负相关的蛋白Akt3，与mTOR通路上的AKT属于同一基因家族^[5]。因此miR-505极有可能通过调控mTOR信号通路发挥其生物学功能，而mTOR通路是目前分子生物学研究的热点，它能整合细胞内和细胞间的信号，起到调控细胞代谢、生长、增殖和存活等过程的中心调控者的作用，mTOR通路的改变与多种疾病相关^[6]。

在细胞水平对小RNA进行研究，可采用合成的双链siRNA或者构建在表达载体上的shRNA转染细胞进行。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体（Lentiviral vector,LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。目前慢病毒也被广泛地应用于表达microRNA的研究中[7]。

1.Bartel DP(2004)MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function.Cell116(2):281-297；

2.Ambros V,朱万渠（2010）：MicroRNAs与疾病和发育生命科学3:27-29；

3.Verduci,L,Simili M,Rizzo M,Mercatanti A,Evangelista M et al.(2010)MicroRNA(miRNA)-mediated Interaction between Leukemia/Lymphoma-related Factor(LRF)and Alternative splicing factor/splicing factor2(ASF/SF2)affects mouse embryonic fibroblast senescence and apoptosis.J Biol Chem,285:39551-39563；

4.Karni R,Hippo Y,Lowe SW,Krainer AR(2008)The splicing-factor oncoprotein SF2/ASF activates mTORC1.Proc Natl Acad Sci USA105(40):15323-15327；