[发明专利]一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法

权利要求书

1.一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法，包括：

（1）采用PCR方法将microRNA-505的shRNA基因从pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR-505扩增得到包含miR-505-3p、miR-505-5p及miR-505-nc的shRNA基因，并用限制性内切酶EcoRI进行酶切，得到经EcoRI酶切后的miR-505片段；

（2）将FUGW载体或Fsy载体用EcoRI进行酶切，并CIAP处理使其5’端去磷酸化，然后将处理后的线性化FUGW载体或Fsy载体与步骤（1）得到的经EcoRI酶切后的miR-505片段进行连接，再转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，并涂布到1%氨苄抗性的琼脂糖平板至长出菌落，对单菌落进行PCR鉴定，初步确定阳性克隆并根据PCR产物大小推测插入片段的拷贝数；将阳性克隆提取质粒后，进行BamHI的酶切，根据产物大小确认外源片段插入的方向，将正确插入的片段进行测序确认，得到表达载体。

2.根据权利要求1所述的一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法，其特征在于：步骤（1）中所述的PCR方法中所用的一对引物如下：

PcDNA-left：5’CCGGAATTCAGTGGATCCTGGAGGCTTG；

PcDNA-right：5’CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC。

3.根据权利要求1所述的一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法，其特征在于：步骤（1）中所述的miR-505-3p、miR-505-5p及miR-505-nc的序列长度分别为173bp、175bp、171bp。

4.根据权利要求1所述的一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法，其特征在于：步骤（2）中所述的连接的具体操作为4℃下过夜连接。

5.根据权利要求1所述的一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法，其特征在于：步骤（2）中所述的PCR鉴定中的引物为：

FUGW–EcoR1Upper：5’CATGGACGAGCTGTACAAGT；

FUGW–EcoR1Lower：5’CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC。