[发明专利]E.coli O157:H7鞭毛蛋白H7抗原片段的表达、纯化及应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是E. coli O157: H7鞭毛蛋白H7抗原片段的表达、纯化及应用， 通过化学合成E. coli O157: H7鞭毛蛋白H7抗原全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组蛋白。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的鞭毛蛋白H7抗原片段，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于E. coli O157: H7抗体的检测及单克隆抗体的制备等，本发明涉及基因工程技术和检测试剂领域。 

背景技术

E. coli O157: H7是致病性E. coli中的一种血清型，由其引起的感染性腹泻是近几年来发现的危害极为严重的肠道传染病。除了引起腹泻，出血性肠炎外，还可以发生溶血性尿毒综合征（HUS）、血栓性血小板减少性紫癜（TTP）等严重的并发征，后者病情凶险，病死率高。1982年，美国首次因其致人出血性肠炎爆发，随后在其他一些国家相继发现由它引起的严重感染。E. coli O157: H7已经逐步成为人类健康的重要威胁, 亟待建立快速准确的检测方法。 

目前针对E. coli O157: H7的主要检测方法有：细菌学分离法，酶联免疫法(ELISA) ，DNA探针及PCR技术等。但这些方法或多或少都存在着实验时间长，不适合现场快速检测等缺点。近年来，免疫金标层析技术在生物医学各领域得到了广泛的应用，为E. coli O157: H7的检测提供了新的思路。筛选E. coli O157: H7外膜特异性抗原，并制备高纯度的特异性抗原，是建立该技术的重要前提。 

鞭毛蛋白H7抗原是肠出血性E. coli O157: H7重要的毒力因子，其编码基因为flic。主要由三部分区域组成：两端高度保守的C1区和C2区及中间高变C3区。H7鞭毛在启动E. coli O157：H7与肠道黏膜、黏液或者同时与两者结合过程中发挥着重要作用。 

  

发明内容

本发明通过化学合成的截短的E. coli O157: H7鞭毛蛋白H7抗原的全新基因片段，利用基因工程技术，制备Flic蛋白高表达片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的Flic蛋白胞外区片段,第215个氨基酸 - 第345个 氨基酸，共131个氨基酸，选择原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达该基因。表达的蛋白可用于E. coli O157: H7抗体的检测或单克隆细胞株的制备。 

本发明筛选出含强抗原表位的Flic蛋白片段，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达产物具有较好的抗原性和特异性，表达的蛋白可用于E. coli O157: H7抗体的检测或单克隆细胞株的制备。 

 E. coli鞭毛蛋白H7抗原片段的表达、纯化及应用是采取以下步骤实现的：

1．flic胞外区抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：

利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析的氨基酸序列， 发现Flic蛋白的C3区（第215个氨基酸 — 第345个氨基酸）含有较强的抗原决定簇。选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5'端增加了BamHI酶切位点（下划线部分），在3'端增加了终止密码子（TAA）和EcoRI酶切位点（下划线部分），使该基因片段易于克隆至质粒pGEX4T-2内的BamHI和EcoRI酶切位点内。

筛选的Flic蛋白片段氨基酸序列（第215个aa － 第345个aa）： 

化学合成的flic基因片段的DNA 序列（412 bp）：