[发明专利]E.coli O157:H7鞭毛蛋白H7抗原片段的表达、纯化及应用

权利要求书

1.一种化学合成的E. coli O157: H7鞭毛蛋白H7抗原片段，该抗原片段编码含强抗原表位E. coli O157: H7 Flic蛋白胞外区基因片段，即第215个氨基酸至第345个 氨基酸，共131个氨基酸，在该基因片段的5'端增加了BamHI酶切位点（下划线部分），在3'端增加了终止密码子TAA和EcoRI酶切位点（下划线部分），化学合成的基因序列全长408 bp，序列如下：

GGATCC ACT ACT GAT GCT GCA TTT GAT AAA TTA GGT AAT GGC GAT AAA GTT ACA GTT GGC GGC GTA GAT TAT ACT TAT AAT GCT AAA TCT GGT GAT TTT ACT ACT ACT AAA TCT ACT GCT GGT ACT GGT GTT GAT GCA GCA GCA CAA GCT GCT GAT TCA GCT TCA AAA CGT GAT GCG TTA GCT GCA ACT CTT CAT GCT GAT GTT GGT AAA TCT GTT AAT GGT TCT TAT ACT ACA AAA GAT GGT ACT GTT TCT TTT GAA ACT GAT TCA GCA GGT AAT ATT ACT ATT GGT GGA AGT CAA GCA TAT GTA GAT GAT GCA GGT AAT TTA ACT ACT AAT AAT GCT GGT AGT GCA GCT AAA GCT GAT ATG AAA GCA CTG CTC AAA GCA GCA AGT GAA GGT AGT GAT TAA CTCGAG 。

2.权利要求1所述的化学合成的E. coli O157: H7鞭毛蛋白H7抗原片段，采用基因工程技术表达该基因序列编码的E. coli O157: H7 Flic蛋白胞外区基因片段，纯化表达的蛋白片段，具体方法如下：

表达E. coli O157: H7 Flic蛋白胞外区基因片段重组质粒的构建:

用 Bam HI和EcoR I双酶切质粒pGEX4T-2和化学合成的E. coli O157: H7的Flic蛋白胞外区基因片段，电泳回收后，用T4 DNA 连接酶连接，使E. coli O157: H7的Flic蛋白胞外区基因片段插入到载体pGEX4T-2内的BamH I和EcoR I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白，全长357个氨基酸,该融合蛋白N端融合了载体上的226个氨基酸，C端包含E. coli O157: H7的Flic蛋白胞外区基因片段，电泳回收后，用T4 DNA 连接酶连接，使E. coli O157: H7的Flic蛋白内的第215个氨基酸至第345个氨基酸，全长氨基酸序列如下：

 

表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定:

将重组质粒转化E. coli BL21(DE3)，涂布含100μg／ml氨苄青霉素的LB平板，置37℃ 过夜，次日随机挑取转化菌落和含质粒pGEX4T-2的对照菌，提取质粒 ，用限制性内切酶BamHI和XhoI对质粒双酶切，1.0％的Agarose凝胶检测双酶切产物应切下约400bp的基片段；将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含氨苄青霉素100μg／mL 的LB培养基内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5 ～1.0 mmol/L,继续振荡培养诱导4～6h， 离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量约为40 kD的E. coli O157: H7 Flic蛋白，表达量约为30%，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带；

表达E. coli O157: H7 Flic蛋白的纯化:

将诱导表达融合蛋白的工程菌离心收菌，菌体重悬于裂解液内，裂解液为50 mmol/L Tris-HCl pH8.0、10 mmol/L EDTA、10 mmol/L　DTT，超声破菌10 min，离心收集上清，上清溶液加已经平衡的Glutathione Sepharose 4B凝胶3ml,室温结合60min,上样，收集穿透液；用十倍柱床体积的1×PBS洗涤柱子，接着用15ml高浓度的GSH洗脱液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0+10 mmol/L GSH）分三次洗脱目的蛋白,即为纯化的E. coli O157: H7的Flic蛋白胞外区片段。