[发明专利]与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域，具体地说，涉及一种与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白。

背景技术

艰难梭菌（Clostridium difficile）是一种厌氧的革兰氏阳性菌，最早发现于1935年，直到1978年发现该菌与临床长期使用某些抗生素（氨苄青霉素、头孢霉素、红霉素、氯林可霉素等）引起的伪膜性肠炎有关，从而逐渐受到重视。目前，科学界已经公认艰难梭菌感染是临床上抗生素相关性腹泻（antibiotic-associated diarrhoea，AAD）以及假膜性肠炎（pseudomenbranous colitis，PMC）的主要病因。在2013年美国疾病预防与控制中心发布的文件中（ANTIBIOTIC RESISTANCE THREATS in the United States,2013）指出，仅在美国一地，每年有超过25万人被艰难梭菌感染，其中14000人因此死亡。每年因治疗艰难梭菌感染所需花费超过10亿美元。

艰难梭菌通过分泌两种外毒素，肠毒素A和细胞毒素B来实现其致病性。其中，毒素B被认为是艰难梭菌感染过程中所必须的外毒素（Lyras,2009）。毒素B通过受体介导的内吞机制进入细胞（Florin,1983），进一步通过糖基转移酶活性使细胞内的GTPase失去活性，从而使肠细胞失去细胞骨架，细胞形态发生变化，肠细胞功能出现异常，引发强烈的腹泻。

由于艰难梭菌具有很强的耐药性，目前尚无一种非常有效的方法治疗艰难梭菌感染（Rupnik,2009）。目前，对于艰难梭菌感染的细胞机制所知甚少，特别是毒素蛋白入胞机制，所应用的宿主受体蛋白尚不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供一种与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白。

为了实现本发明目的，本发明的一种与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白，其为硫酸软骨素蛋白多糖CSPG4，其氨基酸序列如SEQID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明的另一种与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的多肽CSPG4N1-640，其由CSPG4蛋白N端640个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供一种抗艰难梭菌感染的药物，其有效成分为CSPG4或CSPG4N1-640。

本发明还提供一种用于诊断艰难梭菌感染的试剂，所述试剂中含有CSPG4或CSPG4N1-640。

本发明还提供一种用于诊断艰难梭菌感染的试剂盒，所述试剂盒中包括上述试剂。

本发明还提供CSPG4蛋白在制备抗艰难梭菌感染药物及诊断试剂中的应用。

本发明还提供多肽CSPG4N1-640在制备抗艰难梭菌感染药物及诊断试剂中的应用。

本发明还提供CSPG4基因打靶载体，其构建方法包括以下步骤：

1）基于TALEN基因敲除技术，采用ULtiMATE方法(Yang,2013)组装针对CSPG4编码序列5'-TCCAGCCCCCGGCCT-3'以及5'-CTGGCCAACATAGTC-3'的DNA识别区段，并最终克隆至pGL3-TALEN载体中；

2）基于CRISPR系统的基因敲除载体，以CSPG4编码序列5'-TTGGCCAGACTTGCATCCG-3'为靶序列，通过酶切，将U6启动子、靶序列和gRNA5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3'依次连接，并克隆至pGL3-basic载体中，即得CSPG4基因打靶载体。

本发明还提供含有上述打靶载体的宿主细胞，其为人或哺乳动物细胞。

本发明首次发现CSPG4是艰难梭菌细胞毒素B的细胞受体。对CSPG4表达抑制可以显著降低毒素B对细胞的毒性。考虑到毒素B在艰难梭菌感染中的不可或缺的作用，CSPG4将是治疗艰难梭菌感染的重要靶点。