[发明专利]一种高分子量γ- 聚谷氨酸的生产方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物发酵生产高分子材料技术领域，具体地涉及一种高分子量γ-聚谷氨酸的生产方法。 

背景技术

γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基间的酰胺键结合而成的一种多功能生物可降解高分子材料。由于γ-聚谷氨酸及其衍生物具有优良的水溶性和吸附性，能彻底被生物降解，对人和动物安全无毒，可以食用等优点，因而可作为保水剂、增稠剂、絮凝剂、重金属吸附剂、药物/肥料缓释剂及药物载体等，在农业、食品、医药、化妆品、环保、合成纤维和涂膜等领域具有广阔的应用前景。随着化工合成材料造成的环境污染日益严重，开发生物可降解材料在一定程度上替代化学材料已成为整个国际社会的迫切需求。 

γ-聚谷氨酸的制备方法有化学合成、提取和微生物发酵三种方法。微生物发酵法比前两种方法的生产成本低，生产过程对环境的污染小，所以现在主要采用微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸，主要生产菌是芽孢杆菌属的菌株，包括各种（纳豆）枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌，近年来国内外主要以枯草芽孢杆菌来发酵生产。 

γ-聚谷氨酸的分子量和多分散性是其重要的特征参数，Shih等对γ-聚谷氨酸分子量的控制进行了专门研究。一般而言，由芽孢杆菌产生的γ-聚谷氨酸的平均分子量在10⁵-8x10⁶之间，而多分散在2-5之间。分子量越大，其粘性、吸水与保水性越强，应用领域越广泛，但同时，分子量越大，其流变性越难控制，这给生产高分子量的γ-聚谷氨酸带来瓶颈。高华，张艳丽,刘克为以枯草芽孢杆菌纳豆亚种为出发菌株，制备的γ-聚谷氨酸分子量为42.6万道尔顿，（《现代生物医学进展》2009年第14期2637-2640页,2605页,共5页）；中国专利CN 101597627B公开了一种高分子γ-聚谷氨酸的生产方法，利用纳豆菌通过外界环境胁迫的方法提高了γ-聚谷氨酸（γ-PGA）的产率，抑制了γ-PGA的分解，增加了γ-PGA生产的稳定性与大分子量的高粘度特性，γ-PGA的分子量达到300万道尔顿以上，但是纳豆菌难以实现规模化生产。 

目前，国内外对制备γ-PGA研究主要集中在提高γ-PGA的发酵产率上，对γ-PGA分子量的关注很少，这主要与γ-聚谷氨酸的分子量的多分散性有关，在传统的发酵方法中，由于发酵体系中γ-聚谷氨酸分解酶的存在，使得γ-聚谷氨酸在大量生产中存在着分子量和产量 不稳定等问题，且分子量较小，一般在100万道尔顿以下，生产高分子量的生产菌主要是纳豆菌，有时分子量可达300万道尔顿以上。 

γ-聚谷氨酸的分子量范围较难控制，且其得到的γ-聚谷氨酸具体的分子量范围尚不明确，因此，探索一种稳定生产高分子量γ-聚谷氨酸的规模化生产方法迫在眉睫，目前，尚未见利用地衣芽孢杆菌发酵生产高分子量γ-聚谷氨酸的文献报道。 

发明内容

本发明所解决的技术问题是以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.3336为出发菌株，通过液体深层发酵，调整和优化培养条件及培养基组成，生产出分子量较高的γ-聚谷氨酸，提供了一种相对稳定生产高分子量γ-聚谷氨酸的规模化生产方法。 

本发明提供的生产高分子量γ-聚谷氨酸的菌株具体为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.3336。该菌株已于2009年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编100101），保藏号为CGMCC NO.3336，分类命名为：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）TKPG091。 

一种高分子量γ-聚谷氨酸的生产方法，包括如下步骤： 

（1）菌种活化：将地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3336原始菌株接种在斜面培养基上，于37℃培养16小时，如此活化2-3次，制备成熟的斜面种子； 

所述斜面培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH7.2，不足部分纯净水补足； 

（2）种子液的制备：将一环活化后的斜面种子接种于装有50ml液体培养基的500ml三角瓶中，37℃，220rpm培养16小时至对数生长期；