[发明专利]哺乳动物细胞表达的人激肽释放酶和编码基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程基因领域，涉及一种哺乳动物细胞表达的人激肽释放酶-1，编码基因、表达方法和纯化工艺，以及重组蛋白微量检测方法和应用。 

背景技术

激肽释放酶（Kallikrein，KLK）是一种丝氨酸蛋白酶，能使激肽原释放出激肽，它具有很高的生理活性，在人体组织中起着十分重要的生理作用。正常情况下，激肽释放酶大部分是以无活性的前体形式存在。体内的激肽释放酶主要分为两类：血浆激肽释放酶(Plasma Kallikrein))和组织激肽释放酶(Tissue Kallikrein)。两种酶在分子量大小、底物特异性、免疫学特征和释放出的激肽方面都不同。血浆激肽释放酶可参与血凝块的表面激活、纤维蛋白溶解、激肽生成和炎症过程。组织激肽释放酶广泛存在于肾、胰腺、胃肠道黏膜及中枢神经系统等许多组织中，它以激肽原酶原的形式在组织中合成，再经胰蛋白酶激活形成组织激肽释放酶，并可释放至血液循环。 

临床中应用的组织激肽酶1（KLK1）主要来源于猪胰脏提取（例如，常州千红制药，商品名“怡开”）及人尿液中提取（例如，广东天普制药，商品名“凯力康”），二者分别可用于改善微循环等糖尿病并发症以及急性轻-中度缺血性脑卒中疾病的治疗。但是从猪胰脏中提取和纯化猪激肽原酶，过程繁琐且含量很低，由于种属差异，猪激肽释放酶注射具有免疫原性；人尿提取的激肽释放酶-1虽然在蛋白结构、生物活性、免疫反应以及治疗效果等方面都必将优于猪胰激肽释放酶，但是药品来源多数国家难以接受，并且也难以克服病毒污染等缺点。因此要获得高效价廉的重组hK1蛋白，须通过基因工程技术大量制备和生产，使其在大量应用中成为可能。 

目前以哺乳动物为代表的真核细胞表达系统的开发是生物制药产业的发展趋势，采用哺乳动物细胞表达既能保证重组蛋白质二硫键的正确配对和蛋白质折叠，又能保证蛋白质的糖基化，从而使由哺乳动物细胞表达的重组蛋白与天然蛋白在结构和功能上保持很高的一致性。发达国家药物市场中，通过哺乳类动物细胞培养表达的生物药物已达到各类生物药物总数的60％左右，市场份额已接近70％。哺乳动物细胞高效表达和大规模培养技术已成为当今生物制药领域最重要的关键技术之一。中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)表达系统以重组基因高效扩增及表达、重组蛋白与天然蛋白相近、蛋白胞外分泌利于后期纯化、培养 方式简便等特点逐渐成为生产糖蛋白最主要的表达系统。但由于种属差异，以人激肽释放酶天然基因序列转入CHO中表达是难以进行高效的表达的。Lu等1996年（Lu HS，etal Purification and characterization of human tissue prokallikrein and kallikrein isoforms expressed in Chinese hamster ovary cells.Protein Expr.Purif.19968(2):227-237.）在CHO中表达激肽释放酶前体（prokallikrein），经嗜热菌蛋白酶酶切激活后，所获得的激肽释放酶hK1同天然品相比活性无明显区别，但hK1蛋白不均一，蛋白分子量和电荷有差别；李体远等2002年（人组织激肽释放酶基因在哺乳动物细胞中的表达，中国生物工程杂志，200212(6):65-68）构建的带有荧光蛋白基因的激肽释放酶于CHO细胞中表达获得成功，但应用价值不高，表达量也较低；较为相近的利用CHO系统表达hK1蛋白的研究为广州天普生化医药公司制备的hK1蛋白（中国专利201010198962.4），所表达的蛋白生物活性较低，并且表达量远远不能达到工业化的生产需求。除此之外，广州天普生化医药公司在生产重组hK1前期，筛选重组hK1单克隆宿主细胞以及种子培养，培养基中均含有胎牛血清，引入了很多动物源蛋白，具有很多潜在的危险；同时，在扩大制备重组hK1过程中，又采用无血清培养基，这种制备重组hK1的形式已经远远不适应现代医药工业的发展。本申请从转染，筛选以及扩大制备重组hK1均使用化学成分限定培养基，不仅有利于重组hK1制备过程中的下游纯化，减少血清的外源病毒污染等潜在风险；而且使得生产重组hK1的过程控制严格按照GMP要求进行管理和生产。 

发明内容

为了克服现有技术的上述不足之处，本发明首先通过密码子优化的方式，提供一种能在CHO细胞表达系统高效分泌表达重组hK1的编码基因，其次是其可用于生产应用的表达、纯化的方法。 

本发明提供了一种重组hK1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。