[发明专利]哺乳动物细胞表达的人激肽释放酶和编码基因及其应用

权利要求书

1.一种重组人激肽释放酶1的编码基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的编码基因，其特征在于，在所述编码基因之前加有分泌信号肽，所述分泌信号肽的碱基序列如SEQ ID NO:3所示。

3.一种含有如权利要求1或2所述的编码基因的载体，所述的载体为pcDNA3.1(+)，p3×FLAG-CMV13或pCHO1.0，优选为pCHO1.0。

4.一种包含有如权利要求3所述的载体的CHO细胞株，所述细胞株为CHO-K1或CHO-S细胞株，优选为CHO-S细胞株。

5.一种重组人激肽释放酶1蛋白的表达方法，所述方法包含下述步骤：

A.构建含有如权利要求3所述的载体；

B.将步骤A的载体线性化后转入如权利要求4所述的CHO宿主细胞中，并在合适的条件下扩大培养；

C.回收纯化蛋白质。

6.如权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述扩大培养具体包含如下步骤：

A.将CHO细胞宿主接入培养基中，置于培养箱内进行培养；

B.取对数生长期的细胞接入含有3-5g/L微载体的细胞悬浮培养瓶中进行扩大培养，细胞接种数为1～5×10⁵/mL，培养基为含有5～10%FBS的DMEM/F12，转速为45～130rpm，置于培养箱内搅拌培养；

C.当细胞于微载体汇合度大于90%以上，换无血清培养基进行培养；

D.收集含有重组人激肽释放酶的培养基，高速离心并进行预处理。

7.如权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述扩大培养具体包含如下步骤：

A.将单克隆细胞株CHO-S接种于CD FortCD培养基培养；

B.当细胞密度达到5×10⁶/mL后，每隔一天流加2g/L的葡萄糖；

C.检测细胞的活率和密度，直到细胞的活率低于70%时，收集含有重组人激肽释放酶的培养基，高速离心并进行预处理。

8.一种人激肽释放酶1蛋白纯化工艺，所述纯化工艺如下：

A.首先对收集到的如权利要求6或7所述的培养基进行离心收集，浓缩滤0.2μm滤膜，去除病毒和宿主残留DNA。

B.接着用阴离子Q柱从经过预处理步骤A中的培养基捕获重组人激肽释放酶1，并进一步去除病毒和宿主残留DNA等。

C.然后用疏水phenyl柱对上一步收集到的糖基化修饰程度不同的重组hK1进进行分离。

D.最后可以进一步用Benzamidine柱对上一步收集到的糖基化修饰程度不同的重组hK1进一步精纯。

9.一种测定人激肽释放酶1蛋白浓度的方法，所述方法具体包括如下：

A.取已知浓度的人激肽释放酶1蛋白质的标准品获得系列浓度的标准溶液，取所述标准溶液包被酶标板，孵育、洗板、封闭；

B.加入经稀释的人激肽释放酶1的第一抗体，孵育后洗板加入经稀释的酶标记的第二抗体，再次孵育后洗板加入所述酶的荧光底物和双氧水，反应一段时间后，测得荧光值，获得标准曲线；

C.取待测人激肽释放酶1蛋白质获得待测溶液，包被酶标板，孵育、洗板、封闭后，加入所述第一抗体，孵育后洗板加入第二抗体，再次孵育后洗板加入所述酶的荧光底物和双氧水，反应一段时间后，测得荧光值，与所述标准曲线比较，获得所述蛋白质的浓度。

10.如权利要求9所述的蛋白浓度检测方法在高表达人激肽释放酶1单克隆细胞株筛选中的应用。