[发明专利]一种肝素钠的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生化药物领域，涉及一种肝素钠的制备方法，具体涉及一种包括去除肝素钠中的丝氨酸步骤的肝素钠的制备方法以及该制备方法制得的肝素钠。

背景技术

肝素是一类由糖醛酸和氨基葡萄糖以1-4糖苷键连接起来的重复二糖单元组成的线性粘多糖，其广泛分布于哺乳动物的组织中，由结缔组织型肥大细胞表达产生。肝素同大多数粘多糖一样，其在动物体内多以肝素钠-蛋白复合物的形式存在，提取过程中由于肝素钠解离不完全，使得肝素钠中残留一定数量以共价键结合的蛋白质和以静电结合的带正电蛋白质，需要进一步精制才能应用于临床。

因为肝素在生物体内是以肝素蛋白聚糖的形式进行生物合成的，其合成的第一步是形成由规则交替的丝氨酸和甘氨酸残基组成的serglycine蛋白核心，然后通过连续地增加糖胺和糖醛酸，得到一个四糖连接区，并从四糖发生肝素链的延长。因此也可以说肝素蛋白聚糖是由交替的葡糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺二糖单位组成的糖链通过四糖连接区连接到serglycine核心蛋白的丝氨酸残基上。其中，连接区包含以O-糖苷方式连接丝氨酸的木糖，然后依次是两个乳糖和一个葡萄糖醛酸残基。因为O-糖肽键比较稳定，在肝素精制过程中不会完全断裂，因此市场上的精品肝素都不同程度（0.5%～1.5%）的含有丝氨酸残基，表现在核磁碳谱的56ppm左右处会有一个吸收峰。丝氨酸残基的存在将使肝素在储存过程中容易变色，影响药物的质量。同时由精品肝素作为起始原料制备的低分子和超低分子肝素（如亭扎肝素）也会残留一定量的丝氨酸残基。

目前，国内外发表了许多去除肝素中的丝氨酸的方法，其中Keiichi Takagaki（2002）报道了采用具有β-内切木糖苷酶活性的纤维素酶去除肝素丝氨酸的方法；Yu-ki Matsuno（2007）报道了碱性条件下的β-消除反应去除肝素丝氨酸的方法，但是这两种方法均存在局限性，即需要首先分离出特定分子量的肝素片段，然后去除此特定肝素片段的丝氨酸残基，因此不具备工业化生产的条件。Viskov等（2008）发表的专利（US2008/0318328A1）报道了用高锰酸钾去除肝素丝氨酸的方法，但是此方法不可避免会对肝素的四糖连接区造成破坏，对工业化生产存在不利影响。

发明内容

基于上述现有技术，本发明的目的是提供一种肝素钠的制备方法，该制备方法有效地去除了肝素钠中的丝氨酸，改进了现有技术生产的肝素钠不适宜药物工业化生产要求的状况，而且其工艺操作简单，制得的产品的肝素结构完整、效价更高。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种肝素钠的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

（1）将粗品肝素钠水溶液升温至45～50℃，调节pH至8.0～9.0，加入胰酶反应，再加入氯化钙，溶解后升温至80～85℃，再降温至40℃以下，加入碳酸钠，离心取上清液；

（2）将步骤（1）得到的上清液升温至45～50℃，调节pH至4.5～5.5，加入纤维素酶反应，再加入氯化钙，溶解后升温至80～85℃，再降温至40℃以下，加入碳酸钠，离心取上清液；

（3）向步骤（2）得到的上清液加入乙醇或乙醇水溶液，降温至0～5℃，调节pH至1.0～2.0，离心取上清液并调节pH至6.0～7.0；

（4）向步骤（3）得到的上清液加入乙醇或乙醇水溶液，至20℃下的乙醇浓度为40～45°，静置得到湿沉淀；

（5）将步骤（4）得到的湿沉淀溶解在水中，加入次氯酸水溶液，调节pH至4.5～5.0，20～30℃下静置，调节pH至6.0～7.0，加入氯化钠，加入乙醇或乙醇水溶液至20℃下的乙醇浓度为40～45°，静置得到湿沉淀；

（6）将步骤（5）得到的湿沉淀溶解在水中，调节pH至10.0～10.5，加入过氧化氢水溶液，25～30℃下静置，调节pH至6～7，过滤。

在上述步骤（1）中，优选地，所述粗品肝素钠水溶液为除去杂质的粗品肝素钠的水溶液；更优选地，所述除去杂质包括以下步骤：在25～35℃下，将粗品肝素钠溶解于水中，加入氯化钠，调节pH至10.0～10.5，搅拌3.5～4.0小时，然后升温至80～85℃，调节pH至9.5～10.0，静置10分钟，迅速降温至20℃以下，静置4-5小时后过滤，取滤液。进一步优选地，所述粗品肝素钠的效价≥50IU/mg，其0.01%（g/mL）的溶液在波长为260nm时，光吸收值≤1.0。优选地，粗品肝素钠的浓度为20%（g/mL）；优选地，所述氯化钠的浓度为4-5%（g/mL）。