[发明专利]一种酶解法制备蜂王胚胎肽的方法

权利要求书

1.一种酶解法制备蜂王胚胎肽的方法，其特征在于，包括：

步骤1：样品预处理：将蜂王幼虫在存活期内-80℃迅速冷冻，并干燥，将干燥的蜂王幼虫样品研磨成粉；

步骤2：蜂王幼虫粉末脱脂：将预处理过的蜂王幼虫粉末样品放入超临界萃取装置脱脂，脱脂条件：萃取压力35MPa，萃取温度35℃，萃取时间200分钟，常压分离，收集脱脂后的蜂王幼虫蛋白用于进行酶解；

步骤3：蜂王幼虫粉样品液配制：以上述脱脂后的蜂王幼虫粉为原料，该原料中蛋白质的含量为在70％以上，将该蜂王幼虫粉原料按照料液比1∶10(w／v)加入去离子水50℃搅拌混匀4小时，获得蜂王幼虫粉样品液；

步骤4：超声波处理蜂王幼虫粉样品液：使用功率250W～1250W的脉冲超声波进行对蜂王幼虫粉样品液预处理，超声波处理时间30分钟，对应一个脉冲的超声波发出时间2～4s、间隙时间2s；

步骤5：蜂王幼虫粉样品液酶解反应：将超声波处理后的脱脂蜂王幼虫粉样品液pH调至7.5～8.5，在恒温水浴中加热至40℃～60℃，按照酶与脱脂蜂王幼虫粉样品液质量比例0.02～0.04∶1加入复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶和风味蛋白酶按照质量比例1∶1组成，水解度达到20％时停止反应；

步骤6：将酶解液置于沸水浴中加热20分钟灭酶，冷却至常温，将酶解液pH值调至7.0，离心后取上清液；

步骤7：干燥上述上清液获得水解的蜂王胚胎肽粉。

2.根据权利要求1所述的酶解法制备蜂王胚胎肽的方法，其特征在于，所述蜂王幼虫为2～3日龄的蜂王幼虫。

3.一种用于测定权利要求1酶解法制备的蜂王胚胎肽中多肽含量测定方法，其特征在于，利用10％三氯乙酸(TCA)沉淀水解液中大分子蛋白，经过离心过滤后，在上清液中加入双缩脲试剂，于540nm测定其OD值，继而配制Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液，测定标准肽数据，制作标准曲线，在曲线上查找样品中的多肽含量。

4.一种检测水解蜂王胚胎肽的抗氧化活性的方法，其特征在于，包括自由基清除能力测定、超氧阴离子自由基清除能力测定和脂质体过氧化抑制能力测定。

5.根据权利要求4所述的一种检测水解蜂王胚胎肽的抗氧化活性的方法，其特征在于，所述自由基清除能力测定为测定水解蜂王胚胎肽酶解物样品溶液对DPPH自由基的清除除力。

6.根据权利要求4所述的一种检测水解蜂王胚胎肽的抗氧化活性的方法，其特征在于，所述超氧阴离子自由基清除能力测定采用核黄素-光-氮蓝四唑体系测定。

7.根据权利要求4所述的一种检测水解蜂王胚胎肽的抗氧化活性的方法，其特征在于，所述脂质体过氧化抑制能力测定方法是，在10m试管中加入0.2ml脂质体溶液，不同体积的样品和50mmol／L FeSO4溶液50ul，再加入磷酸盐缓冲溶液至3mL不加样品的反应物管作为模型，不加FeSO4溶液的试管作为空白，将反应物置于37℃水浴40分钟，最后加入10％三氯乙酸1ml，0.8％硫代巴比妥酸(TBA)1ml，混合均匀，置于沸水中15分钟，冰水冷却，在8000r／min下离心10分钟，取上清液在532nm处测定吸光度(A)，按照以下计算公式计算脂质过氧化的抑制率：脂质过氧化的抑制率(％)=(A模型一A样品)／(A模型一A空白)×100％。