[发明专利]一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母

说明书

技术领域

本发明涉及遗传工程和发酵工程领域，更具体地，涉及一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母。

背景技术

目前我国车用燃料乙醇几乎都是用粮食玉米等为原料生产，大量生产燃料乙醇势必会带来车与人争粮的问题，直接推动粮食价格的不断上涨，并且会有引发食物短缺的危机。解决方式是尽量由非粮的可再生生物质为原料生产乙醇。餐厨废弃物是一种数量巨大的可再生生物质资源，在我国每年的餐厨废弃物产量在6000万吨以上，大部分被用来喂猪、填埋、焚烧，甚至制造“地沟油”，造成了严重的环境污染，少部分得以合理利用，比如制造堆肥和沼气等等，但经济效益低下。因此，用这些餐厨废弃物作为原料来生产燃料乙醇将会是一个颇具前景的发展方向，既可以变废为宝，又可以缓解粮食与能源危机。

餐厨废弃物是一种营养丰富的可再生生物质，富含淀粉、糖类、蛋白质、脂肪等有机物，其中有机物含量占干物质的95%以上。餐厨废弃物同时还含有维生素、氮、磷、硫、钾、钙、镁等微量元素，营养元素齐全，能够被生物再利用，具有再利用价值。由于餐厨废弃物含水量高、营养物质丰富，在常温条件下微生物会利用各类有机物和无机盐快速繁殖进行代谢，使餐厨废弃物腐烂发臭，污染环境，为处理带来麻烦。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是工业上进行乙醇发酵的首选菌种，具有将葡萄糖高效转化为乙醇的能力，但其缺乏有效降解淀粉生成葡萄糖的酶，以及缺乏降解蛋白质成为多肽和氨基酸的酶，在自然条件下不能直接利用餐厨废弃物中的淀粉和蛋白质作为碳源和氮源来发酵产生乙醇。因此，若需将餐厨废弃物作为原料发酵生产乙醇，必须将能降解淀粉和蛋白质的酶基因导入酿酒酵母并实现分泌表达，以遗传工程手段弥补酿酒酵母降解利用餐厨废弃物的能力缺陷，使得基因重组酿酒酵母可以利用自身分泌的淀粉酶和蛋白酶将餐厨废弃物中的淀粉和蛋白质降解成为可以利用的碳源——葡萄糖和氮源——多肽和氨基酸，从而可实现利用餐厨废弃物发酵生产燃料乙醇的工业化目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母。

    本发明所要解决的另一技术问题是，提供一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母的构建方法。

一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母，该基因重组酿酒酵母是将α-淀粉酶（α-amylase, AMY）基因、糖化酶（glucoamylase, GA）基因、酸性蛋白酶（acid protease, AP）基因通过酿酒酵母表达载体同时转入酿酒酵母并获得正确的分泌表达而构建成的。

本发明的重点在于将α-淀粉酶基因、糖化酶基因和酸性蛋白酶基因转入酿酒酵母中并使其分泌表达，所用的工具为酿酒酵母表达载体，作为一种优选方案，所述的酿酒酵母表达载体为酿酒酵母多基因共表达载体；酿酒酵母多基因共表达载体可以实现将α-淀粉酶基因、糖化酶基因和酸性蛋白酶基因同时转入酿酒酵母中。作为一种优选方案，所述酿酒酵母多基因共表达载体为载体pScIKP（制备方法见专利ZL 200810029630.6），当然也可以使用其他类型的酿酒酵母多基因共表达载体。

一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：

S1.通过PCR扩增分别得到α-淀粉酶基因、糖化酶基因和酸性蛋白酶基因序列；将糖化酶基因的1566位的核苷酸残基C人工突变成为T，酸性蛋白酶基因的1155位的核苷酸残基C人工突变成为T；

S2.将α-淀粉酶基因、糖化酶基因和酸性蛋白酶基因接入酿酒酵母表达载体中，构建重组多基因共表达载体；

S3.将上述构建得到的重组多基因共表达载体用限制性内切酶切割，使之线性化后转化到酿酒酵母中，构建基因重组酿酒酵母。

作为一种优选方案，S2构建重组多基因共表达载体包括如下步骤：

S11.用限制性内切酶分别切割酿酒酵母表达载体、α-淀粉酶基因、糖化酶基因、酸性蛋白酶基因；

S12.将α-淀粉酶基因、糖化酶基因、酸性蛋白酶基因分别接入酿酒酵母表达载体，形成三个重组单基因载体；

S13.将含有载体启动子和终止子片段的完整的α-淀粉酶基因表达盒、糖化酶基因表达盒和酸性蛋白酶基因表达盒使用限制性内切酶分别从三种重组单基因载体上切下，然后以串联表达盒amy-ga-ap的形式逐个接入同一酿酒酵母表达载体中。

作为一种优选方案，S3中所述的限制性内切酶为Apa I。