[发明专利]一种稳定分泌表达IL-24重组蛋白的细胞株及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤生物治疗技术领域，具体涉及一种稳定分泌表达IL-24重组蛋白的细胞株及其构建和应用。

背景技术

美国哥伦比亚大学Fisher PB教授实验室1995年用重组人IFN-β和密执毒素（mezerein,MEZ）处理人黑素瘤细胞（H0-1）后，通过消减杂交鉴别出mda-7/IL-24（白细胞介素24）。它的分布具有高度局限性，仅分布在免疫系统（如脾、胸腺、外周血白细胞）和特定细胞（如黑色素细胞、痣、早期黑色素瘤细胞、平滑肌细胞、皮肤成纤维细胞、皮肤伤口边缘和基底类成纤维细胞样细胞），在50多种肿瘤细胞中未检测到IL-24蛋白的表达。

近十八年的研究表明，IL-24是抗肿瘤的“明星”分子。首先，能够在体内和体外抑制多种癌细胞和肿瘤生长，选择性诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无明显毒副作用，因而认为IL-24是一种新的肿瘤抑制基因。其次，IL-24与其他的肿瘤抑制基因不同，它对肿瘤细胞的生长抑制作用不依赖于肿瘤细胞中p53、p21、Rb和其他肿瘤抑制基因的表达与否，它能特异性地杀死MCF7和HeLa，而p53对这两种细胞无法发挥杀死作用，它是具有广谱抗瘤活性的肿瘤抑制基因。同时，IL-24具有免疫调节能力，它能刺激外周血单核细胞PBMC产生IL-6、TNFβ、IFNγ，但对人PBMC无刺激增殖作用。正在用于基因疗法临床试验的p53、p10、Rb等抑癌基因，均不具有通过刺激免疫应答来杀伤肿瘤细胞的特性，IL-24很可能是第一个既抑制肿瘤生长又刺激免疫系统的基因。最后，IL-24和其他药物（表皮生长因子受体EGFR抑制剂gefitinib、Her2的单抗Trastuzumab/Herceptin、Tamoxifen、Taxotere和Adriamycin）的联合使用可产生叠加的抗瘤效果，能够提高对二者单独作用都不敏感的肿瘤细胞的药物敏感性，在临床上给这类肿瘤患者带来新的治疗希望。因此，对IL-24基因的研究具有非常重要的理论和临床意义。

腺病毒作为基因转移工具相对于其他病毒载体更有优势，如腺病毒颗粒比较稳定、操作简单、可感染分裂细胞和非分裂细胞、外源基因表达水平较高。然而，腺病毒的靶向性问题、腺病毒的清除、生物安全性等缺陷限制了它的发展。相比较于腺病毒载体，以基因工程蛋白药物（蛋白和多肽）形式直接给药就更为安全。

IL-24蛋白独特的生物学活性促使研究人员对它的重组蛋白进行研究，以期能够早日进入临床试验研究。目前已在大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞中获得重组的IL-24基因工程蛋白，但在不同宿主细胞中获得的基因工程蛋白的生物学活性具有显著差异。用大肠杆菌和酵母表达的IL-24重组蛋白同样具有免疫调节作用，可以刺激IL-6、TNF-α和INF-γ高水平表达以及GM-CSF低水平表达，但所用剂量很大（单位是μg/mL），而在HEK293细胞上清中分泌表达IL-24重组蛋白所用剂量单位是ng/mL；在用IL-24重组蛋白杀死黑色素瘤细胞的研究中，大肠杆菌表达的重组蛋白在20mmol/L浓度时仍无作用，在HEK293细胞中分泌表达的重组蛋白在15-500pmol/L时就具有显著的作用，可能是因为在细菌和酵母中表达的重组蛋白没有正确折叠或没有翻译后的糖基化修饰，使受体无法识别。同时发现在啮齿类动物细胞和昆虫细胞中分泌表达的IL-24蛋白的糖基化修饰程度很低。这些结果表明，哺乳动物细胞表达体系对保持IL-24重组蛋白的生物学活性至关重要。