[发明专利]同时检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号与4号小种的LAMP方法

说明书

 

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于LAMP技术同时检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种与4号生理小种的LAMP方法。

背景技术

香蕉枯萎病，又称香蕉巴拿马病、香蕉黄叶病，是一种重要的、最具毁灭性的香蕉病害之一，给香蕉种植业造成严重损失。该病属维管束型土传真菌病害，可通过种苗、土壤、流水和人为因素传播，故对枯萎病的预防和控制是一个世界性难题。香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)是植物病害中系统浸染、土壤传播、抗逆性强、致病性变异较大的病原菌之一，极难防治。因此, 我国2007年将其列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。准确、快速地鉴定香蕉病菌，对于做好我国香蕉检疫和防治工作具有重要意义。

目前国内通用的GB、SN等标准采用培养接种等生物学检测方法和PCR、基因芯片和测序比对等分子生物学检测方法辅助相结合的方法，检验周期需要2-7天，且操作复杂，成本较高，难以适应当代贸易中快速检验的客观需求。尤其是在田间地头和码头海港等野外工作条件下，不具备PCR往往无法开展快速检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种与4号生理小种的LAMP方法，以满足对出入境检验检疫中尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种与4号生理小种的鉴定。

实现本发明的技术方案为：

同时检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号与4号小种的LAMP方法，所述检测方法包括LAMP 引物的设计与合成、模板DNA的提取、LAMP 扩增体系建立，LAMP 扩增方法，所述的LAMP 扩增方法反应温度为63℃左右、反应在90min 内完成扩增，引物包括外引物、内引物；

所述的外引物是F3 和B3 ；

所述的内引物是FIP 和BIP；

所述引物序列自5' 端到3' 端如下：

F3：TTGCACCAGAAACGGTAT

B3：TTGCACCAGAAACGGTAT

FIP：TATCAGCTTGCTCCCCTGC-CGATGACCTCAATAACAAAACC

BIP：AGAGGCATAATTGGTTGTAGTGC-TTTTTTGGTGGCCCATGT

    其中，所述模板DNA提取指植物或菌体组织DNA的提取，离心提取其核酸，具体步骤为：

称取80mg样品，加入到2ml的离心管中；加入600μL裂解液充分混匀。65℃温浴至少30分钟。然后加入300μL蛋白沉淀液，13000rpm离心4min。将上清液转移至另一干净的1.5ml离心管中；若上清很混浊可以再加等体积的氯仿/异戊醇（24：1）颠倒混匀，13000rpm离心4min,将上清液转移至另一干净的离心管中；加入0.8倍体积异丙醇，-20℃沉淀30min。13000rpm离心4min，弃上清，加入600μL 70%乙醇，13000rpm离心4min，弃上清，晾干，加TE溶液30μL溶解。

    所述LAMP 扩增体系建立是采用水溶液配置，体系总体积25μL，其中包括：

模板DNA   2μL

2×U-LAMP MIX  17μL

F3  5uM， 1μL

B3  5uM， 1μL 

FIP 40uM， 1μL

BIP 40uM， 1μL

Bst DNA 酶    8 U/μL， 1μL

荧光染料  1μL。

    所述LAMP扩增方法采用实时荧光PCR仪，将按照LAMP扩增体系配制好的试剂加入反应器中，63℃左右反应1小时，共分为40个循环，每个循环1分钟30秒，每个循环结束时收集荧光。

所述LAMP扩增方法采用普通水浴锅或金属浴完成，将按照LAMP扩增体系配制好的试剂加入PE管中，放入63℃左右水浴锅中保温90min，然后取出放入另一80℃水浴锅中保温10 min后，取出。

本发明与现有技术相比其显著优点是：

1、兼顾两个生理小种，同时检测无遗漏。能够同时检测出植物或菌体组织中的尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种与4号生理小种。

2、操作简便，成本低廉。环介导等温扩增（LAMP）方法是具有与PCR技术同等甚至超越的优势，加之对仪器设备要求宽松，不用PCR仪，简单易行，周期短至1小时，可缩短检验周期50%以上，可实现大量样品的快速检测，适合进行现场及大量样品的高通量检测。