[发明专利]同时检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号与4号小种的LAMP方法无效
| 申请号： | 201310737490.9 | 申请日： | 2013-12-30 |
| 公开（公告）号： | CN103773854A | 公开（公告）日： | 2014-05-07 |
| 发明（设计）人： | 杨雷亮;孙丽霞;陈定虎;邱德义;王章根;管维 | 申请（专利权）人： | 中华人民共和国中山出入境检验检疫局 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/77 |
| 代理公司： | 南京理工大学专利中心 32203 | 代理人： | 朱显国 |
| 地址： | 528403*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 同时 检测 镰刀 古巴 专化型 号小种 lamp 方法 | ||
1.一种同时检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号与4号小种的LAMP方法，其特征在于：所述检测方法包括LAMP 引物的设计与合成、模板DNA的提取、LAMP 扩增体系建立，LAMP 扩增方法，所述的LAMP 扩增方法反应温度为63℃左右、反应在90min 内完成扩增，引物包括外引物、内引物；
所述的外引物是F3 和B3 ；
所述的内引物是FIP 和BIP；
所述引物序列自5' 端到3' 端如下：
F3：TTGCACCAGAAACGGTAT
B3：TTGCACCAGAAACGGTAT
FIP：TATCAGCTTGCTCCCCTGC-CGATGACCTCAATAACAAAACC
BIP：AGAGGCATAATTGGTTGTAGTGC-TTTTTTGGTGGCCCATGT。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述模板DNA提取指植物或菌体组织DNA的提取。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述LAMP 扩增体系建立是采用水溶液配置，体系总体积25μL，其中包括：
模板DNA 2μL
2×U-LAMP MIX 17μL
F3 5uM， 1μL
B3 5uM， 1μL
FIP 40uM， 1μL
BIP 40uM， 1μL
Bst DNA 酶 8 U/μL， 1μL
荧光染料 1μL。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述LAMP扩增方法采用实时荧光PCR仪，将按照LAMP扩增体系配制好的试剂加入反应器中，63℃左右反应1小时，共分为40个循环，每个循环1分钟30秒，每个循环结束时收集荧光。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述LAMP扩增方法采用普通水浴锅或金属浴完成，将按照LAMP扩增体系配制好的试剂加入PE管中，放入63℃左右水浴锅中保温90min，然后取出放入另一80℃水浴锅中保温10 min后，取出。
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