[发明专利]一种用于检测猪流行性腹泻病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪病毒的检测方法，属于生物技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒的PCR检测引物及检测方法。 

背景技术

猪流行性腹泻(PED)由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的以腹泻、呕吐和脱水为特征的猪肠道传染病。该病多发生在冬春寒冷季节，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪等各年龄段均可发病，但哺乳仔猪发病和死亡最为严重。20世纪80年代后该病在中国流行面逐渐扩大，并多与猪传染性胃肠炎、轮状病毒等其他肠道病原混合感染，给养猪业造成严重经济损失。 

该病的流行特点、临诊症状和病理变化都与猪传染性胃肠炎(TGE)非常相似，为了及时预防和治疗该病毒导致的腹泻，需要快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒的特异方法，因此建立PEDV的RT-PCR检测方法具有重要的意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒的RT-PCR引物及检测方法，该方法通过设计猪流行性腹泻病毒基因的特异引物，建立猪流行性腹泻病毒的RT-PCR方法，为方便、快速、有效地检测该病毒打下基础。 

1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒的方法，包含RT-PCR的检测PED病毒，其特征在于：所述RT-PCR引物： 

PEDVF：AACGGTTCTATTCCCGTTGATG 

PEDVR：TAAATGAAGCACTTTCTCACTATC 

2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪流行性腹泻病毒的方法，其特征在于：PED病毒RT-PCR的检测方法首先提取待检样的RNA，通过反转录形成cDNA，然后以反转录的cDNA为模板，建立PEDV的RT-PCR检测，RT-PCR的产物为663bp。 

3.根据权利要求2所述的PEDV的RT-PCR检测方法，其特征在于：所述的RT-PCR检测方法具体包括以下步骤： 

(1)待检样RNA的提取； 

(2)将提取的RNA通过反转录成cDNA，反应程序和反应体系如下： 

取总RNA5.75ul、反向引物RNA1ul、10mmol／L dNTPs0.5ul、5×Buffer2ul、100U／ul反转录酶AMV0.5ul、RNA酶抑制剂0.25ul，总体积10ul，50℃反应1h，95℃灭活5min，即得cDNA。 

(3)将获得的反转录产物进行PCR扩增，反应体系和反应程序如下： 

取RT产物1ul，2×Mix12.5ul，正向引物和反向引物各1ul，高压灭菌水9.5ul，总体积25ul，置入PCR 仪，反应条件：94℃30second，56℃30second，72℃20second，35个循环，即得扩增产物。 

(4)RT-PCR产物的检测结果：根据琼脂糖凝胶电泳检测的DNA图谱，若扩增出分子量为663bp的特异DNA条带则标记为携带PED病毒，若未扩增出特异DNA条带则表示未携带PED病毒。 

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 

本发明的引物特异性高，鉴定速度快，整个RT-PCR过程可以在2.5-3小时完成，不需要经过测序公司测序就能快速准确的鉴定PEDV，为临床检测节省大量时间。 

附图说明

图1PEDVPCR扩增电泳结果 

图2PEDV RT-PCR特异性电泳图结果 

图3PEDVRT-PCR敏感性电泳图结果 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

实施例猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法建立。 

1引物设计：在GenBank中查找多个毒株，对其进行同源性分析，利用Primer5对上述保守区进行引物设计，对设计出来的病毒检测引物进行引物二聚体分析，以避免引物之间形成稳定的引物二聚体，从而确定该病毒的引物序列，见表1。 

表1 

2、RT-PCR反应条件优化 

利用商品化的RNA提取试剂盒提取疑似PEDV致死仔猪的肠及其内容物，提取方法参照RNA提取试剂盒操作说明进行。