[发明专利]一种丙型肝炎病毒一步法核酸定量/基因分型RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种生物检测技术，尤其涉及一种用于丙型肝炎病毒核酸的荧光定量检测，同时对样本进行基因分型检测的试剂盒。 

背景技术

病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的，以肝脏损害的一组全身性传染病。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是丙型病毒性肝炎的主要致病病毒。HCV基因组序列具有高度变异性，根据不同区域的基因序列变异情况，HCV可分为1、2、3、4、5和6型等6个基因型和80多种基因亚型。丙型肝炎病毒的遗传多样性对疾病进程及药物治疗反应性都有很大影响。近年来的研究表明，HCV的基因型与丙型肝炎的治疗方案及治疗周期关系密切。 

目前，临床上更多应用干扰素和利巴韦林联合治疗HCV。研究表明，不同基因型HCV感染者在用α-干扰素联合利巴韦林治疗过程中所产生的持续病毒学应答(sustained virological response，SVR)比例有所不同：1、4、5和6型持续病毒学应答比例为30％，2和3型持续病毒性应答比例为65％。且，1型HCV的体内复制速度明显高于其他基因型，1b患者肝脏组织学分级、病程进展速度也明显高于2型。 

中国流行的HCV有1型、2型、3型和6型等4种基因型。2011年针对我国汉族CHC病毒基因型和宿主基因型的横断面研究纳入了997例初治患者，结果显示最主要的HCV基因型为1型，占58.4％，其中1b亚型占所有基因型的56.8％，表明在我国“难治性丙型肝炎”占主导；2型次之(24.1％)，之后为3型(9.1％)、6型(6.3％)和混合感染(2.1％)，未发现4型和5型。1型和2型在全国范围广泛分布，3型和6型主要见于南方和西南(如云南、广西壮族自治区、广东、福建等)，2种型加起来可占到这些地区基因型的40％左右。 

由此可见，HCV基因分型在HCV感染、传播、诊断、诊疗、预防等方面均有重要意义，可作为HCV感染的诊断和重要的预后指标，有助于针对不同HCV基因型感染患者用药剂量及相关疗程的监测。结合HCV各基因型对干扰素治疗所产生的持续病毒学应答的差异及其在中国的流行态势，区分HCV1型、2型和6型对丙型肝炎临床诊断治疗具有重要的现实意义。 

临床上，丙型肝炎病毒(HCV)的诊断主要依赖实验室检查。对HCV检测诊断的主要方法有：丙型肝炎病毒抗体(抗HCV)的检测和多聚酶链法(PCR)检测丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV-RNA)。在实验室诊断技术中，放射免疫诊断(RIA)或酶联免疫试验(ELISA)是确诊HCV感染的金标准，但检测的准确率受方法学的灵敏度以及操作者的熟练程度、标本质量等因素影响。 

当前，基于TaqMan探针技术的荧光定量PCR是融汇了PCR高敏感性、DNA杂交技术高特异性和光谱技术高精确定量三大技术的一种新的检测方法，该方法取材简单，操作方便，完全封闭式操作避免了检测时的标本被污染和对环境的污染，能简便、微量、快速、高特异、高敏感、定量、无污染地检测丙型肝炎病毒，还可以以量化指标来评估疗效。因此，荧光定量PCR法是临床早期诊断HCV感染的最有价值的方法之一。 

TaqMan探针技术是高度特异的荧光定量PCR技术。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’-末端，淬灭基团在探针3’-末端。当探针完整或与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’-端的淬灭基团接近而被淬灭，无荧光信号产生。在进行PCR反应延伸过程时，Taq DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性将探针降解，使得荧光基团与淬灭基团分离，即产生荧光信号。每经历一个PCR反应循环，就有一分子的扩增产物生成，并伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团信号不断积累，为一个指数同步增长的过程，荧光信号的强度就代表了扩增产物的拷贝数。该技术具有特异性强、自动化程度高等特点、有效解决了PCR污染等问题。HCVRNA荧光定量检测正是基于这种原理设计，为HCV早期感染诊断、大规模筛查、疗效动态分析、新药开发等提供良好的技术支持。目前，国内外已上市多种HCV定量检测试剂和HCV分型检测，而将二者融合在一起进行检测的试剂盒尚未发现；本试剂盒的开发成型可填补该方面技术和产品的空白。