[发明专利]包裹纳米金颗粒的PEG功能化的PAMAM树状大分子载体的基因转染方法

说明书

技术领域

本发明属于功能化高分子纳米载体用于基因转染领域，特别涉及一种包裹纳米金颗粒的PEG功能化的PAMAM树状大分子载体的基因转染方法。

背景技术

目前，随着科技的发展，基因治疗为癌症及一些遗传性疾病的治疗带来了福音，被认为是未来癌症治疗中最具前景的治疗技术。基因治疗用于癌症的治疗相对于传统的基因治疗方法的优势在于：具有高的靶向性，效果显著，治疗过程中病人痛苦少，在治疗过程中对正常细胞的损害少。

基因治疗的关键在于寻找安全高效的基因载体，通常情况下，用于基因传递的载体包括病毒载体和非病毒载体。虽然病毒载体的研究开始的早，应用的早，但是随着研究的深入病毒载体高的免疫源性和高的毒性，限制了病毒载体在基因转染领域的深入应用。近几年来，科学研究者开始探索非病毒载体在基因转染的应用。在非病毒载体中PAMAM树状大分子成为目前研究的热点。这和其特有的有利于基因传递的性质有关联，比如，纳米级的球形结构易于被细胞吞噬，丰富的末端氨基可以被赋予不同的功能，内部大的空腔可以包裹金纳米颗粒以及其他的一些无机颗粒增加其刚性以及质粒或siRNA的装载量等。

在目前报道，树状大分子高的毒性限制了其在基因转染领域的应用，为了解决这个难题大多数研究者采用了在树状大分子表面接枝一些功能基团比如，乙酰基，PEG和一些氨基酸等希望降低树状大分子的毒性同时增加树状大分子的基因转染效率。本课题组前期的研究从树状大分子内部大的空腔可以包裹纳米颗粒着手，将金纳米颗粒包裹到树状大分子中形成树状大分子包裹纳米金颗粒的基因载体，研究结果表明这种对树状大分子的改造不但降低了树状大分子的毒性而且增加了树状大分子的基因转染效率（Shan et al.Biomaterials2012,33,3025-3035）。因此本发明旨在探索结合上述两种改造第五代树状大分子的方式，即在第五代树状大分子表面修饰功能分子，同时在树状大分子的内部包裹纳米金颗粒。为了实现这个设想，我们选择了将PEG修饰在第五代树状大分子的表面能够增加树状大分子的亲水性，较低其细胞毒性，同时在树状大分子内部包裹纳米金颗粒增加第五代树状大分子的刚性结构。此外，本发明旨在探索基因治疗的新方向，合成的载体不仅用于pDNA的转染，也用于siRNA的转染。

检索国内外相关文献和专利结果表明：以PEG化的包裹金纳米颗粒的PAMAM树状大分子为载体，用于基因转染的方法，尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种包裹纳米金颗粒的PEG功能化的PAMAM树状大分子载体的基因转染方法，该方法具有转染条件温和，易于操作，转染效率高等优点，不仅可以用于pDNA转染，也可以用于siRNA的转染，在癌症的治疗等方面具有很好的发展前景。

本发明的一种包裹纳米金颗粒的PEG功能化的PAMAM树状大分子载体的基因转染方法，包括：

（1）将mPEG-COOH溶于DMSO中，用EDC的DMSO溶液活化，得到活化好的mPEG溶液；

称取第五代PAMAM树状大分子（G5.NH₂）溶于DMSO中，按照mPEG-COOH/G5.NH₂摩尔比为10/1，加入活化好的mPEG溶液，室温下磁力搅拌，反应得到G5.NH₂-mPEG₁₀溶液；

（2）在上述G5.NH₂-mPEG₁₀溶液中逐滴加入HAuCl₄水溶液，搅拌后快速加入NaBH₄溶液，还原反应结束后，将反应产物透析，然后进行冷冻干燥处理，得到反应产物Au⁰-G5.NH₂-mPEG₁₀；

（3）将Au⁰-G5.NH₂-mPEG₁₀与pDNA或siRNA制备载体/基因复合物溶液；

（4）采用上述载体/基因复合物溶液进行细胞转染。

步骤（1）中所述的mPEG的分子量为2000或5000。

步骤（2）中所用的HAuCl₄与G5.NH₂-mPEG₁₀的摩尔比为25:1或50:1。

步骤（2）中所述的透析为将反应产物在蒸馏水中透析3天，一天3次，采用截留分子量为14000的透析袋。