[发明专利]TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞HUVEC炎症反应模型的制备方法

说明书

一、技术领域

本发明为一种TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞HUVEC炎症反应模型的制备方法，属于生物技术领域。

二、背景技术

人脐静脉内皮细胞HUVEC是从正常人体脐带分离得到的静脉血管内皮细胞，可表达多种炎症因子及与血管收缩或舒张相关的多种关键酶，是生理、药理研究中广泛应用的细胞模型系统。

TNF-α是重要的促炎症细胞因子，在心血管疾病中起重要作用。TNF-α是一种主要由活化的单核巨噬细胞产生的糖蛋白，是一种重要的促炎症细胞因子，在心血管疾病的发生及发展过程中起到重要作用。TNF-α可以引起血管内皮细胞功能障碍，继而产生多种细胞因子如细胞间粘附因子(ICAM-1)、血管细胞粘附分子(VCAM-1)，单核细胞趋化因子(MCP-1)等，从而引起白细胞及单核细胞迁移至血管屏蔽，引起血管炎症反应。正常内皮细胞几乎不表达MCP-1，ICAM-1和VCAM-1蛋白，或表达量很少。经TNF-α刺激之后，内皮细胞MCP-1，ICAM-1和VCAM-1蛋白的表达明显增加，且蛋白表达量的变化与TNF-α的浓度和刺激时间有密切关系。进过我们实验发现在TNF-α浓度为10ng／ml及刺激6h时，三者表达量均达到峰值。

利用TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC产生炎症反应细胞模型，可以用于深入探讨血管内皮细胞炎症损伤的机制，预防和调节过激的炎症反应，保护内皮细胞功能，对预防和治疗血管炎症疾病具有积极的意义。

三、发明内容

技术问题本发明主要是提供一种用TNF-α诱导来制备人脐静脉内皮细胞HUVEC炎症细胞反应模型的方法。

技术方案本发明为一种TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞HUVEC炎症反应模型的制备方法，包括：

1)HUVEC细胞培养：HUVEC细胞用M199完全培养基(含酚红、20％新生小牛血清、2mmol／L L-谷氨酰胺、100U／ml青霉素、100U／ml链霉素、100μg/ml血管内皮细胞生长因子-肝素)置于37℃，5％CO₂的温箱中培养。

2)HUVEC样品制备：待细胞长满至80％-90％单层，用15ml的1mg/ml的I型胶原酶消化15-20min制备成细胞悬液，取10ul于血球计数板上计数，调整细胞浓度为1*10⁶／ml。

3)HUVEC细胞同步化：取2ml细胞悬液至6孔板进行培养，当细胞长满至90％时，换无血清的培养基进行饥饿培养24h，使所有细胞同步化。

4)TNF-α诱导HUVEC细胞炎症反应：加入终浓度为10ng/ml的TNF-α，刺激HUVEC细胞6h，取细胞上清液用ELISA法测定细胞炎症因子MCP-1、ICAM-1、VCAM-1，蛋白含量均升高。

有益效果本发明旨在建立一种简单易行的炎症反应体外细胞模型。本方法选用TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞HUVEC的多种炎症因子，明显提高了HUVEC细胞MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表达含量。此炎症反应细胞模型，可以用于深入探讨血管内皮细胞炎症损伤的机制，预防和调节过激的炎症反应，保护内皮细胞功能，对预防和治疗血管炎症疾病具有积极的意义。

四、具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1

用M199完全培养基在37℃，5％CO₂的温箱中培养HUVEC细胞至细胞长满80％-90％单层，用15ml的1mg/ml的I型胶原酶消化15-20min制备成细胞悬液，取10ul于血球计数板上计数，调整细胞浓度为1*10⁶／ml。取2ml细胞悬液至6孔板进行培养，当细胞长满至90％时，换无血清的培养基进行饥饿培养24h，使所有细胞同步化。加入终浓度为10ng/ml的TNF-α，刺激HUVEC细胞6h，取细胞上清液ELISA法在酶标仪450nm下测定OD值，检测细胞炎症因子MCP-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白，结果表明MCP-1浓度从0.130±0.007μg/L上升到0.608±0.018μg/L(P＜0.001)，ICAM-1浓度从0.133±0.002μg／L上升到0.669±0.033μg/L(P＜0.01)，VCAM-1浓度从0.147μg／L±0.011μg/L上升到0.538±0.019μg/L(P＜0.01)，三者的蛋白含量均升高。