[发明专利]口蹄疫灭活疫苗中间品或抗原146S含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于兽医学领域，具体为口蹄疫灭活疫苗中间或抗原品146S含量的测定方法。

背景技术

口蹄疫（Food and Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Food and Mouth Disease Virus，FMDV）引起的偶蹄类动物的急性、热性、接触性、烈性传染病。由于该病的发生会造成巨大的经济损失和政治影响，因此，口蹄疫防治工作始终得到世界各国政府的高度重视。疫苗接种是我国预防控制口蹄疫的重要战略，农业部要求强制免疫接种，免疫密度常年维持在90％以上，其中应免畜禽免疫密度要达到100％，各口蹄疫生产厂家检验用阴性动物（牛、猪）基本无处可选，企业面临无检验动物可用的局面，因为口蹄疫灭活疫苗效力评价方法是采用OIE标准的本动物（牛、猪）半数保护量（PD50）检测方法，即用健康易感牛或猪（乳鼠中和抗体滴度≤1:4或细胞中和抗体滴度≤1:8或ELISA抗体效价≤1:16）30头，将待检疫苗按3组（1头份、1/3头份、1/9头份）各接种10头牛。21～28日后连同对照牛非别攻击O型、亚洲I型口蹄疫病毒强毒104ID50，根据免疫牛保护数，按Reed-Muench法计算被检疫苗的PD50。而初步估计国内6个口蹄疫定点生产厂每年口蹄疫阴性牛使用量最少应该在10000头左右，猪至少在20000头，要想保证这个数量非常困难。所以口蹄疫灭活疫苗效力评价筛选检验用阴性动物非常困难，同时各企业动物来源、动物品系均不同，动物来源复杂、背景不清，不易标准化等问题严重困扰着我国口蹄疫疫苗生产企业。同时这种方法需要大面积负压强毒动物舍，感染动物体外排毒造成活病毒逃逸是一直困扰专家的难题。

为了解决口蹄疫疫苗检验用本动物来源困难这一现实问题，2005年，对牛的口蹄疫疫苗农业部提出并批准生产企业每连续生产五批疫苗选择进行一批效力评价的策略，虽然稍稍缓解动物来源的困难，但是又为市场疫苗质量、口蹄疫的发生埋下了隐患，因为未进行效力评价的疫苗进入市场后效力一旦存在问题，就会出现不可估量的损失。所以2006年农业部兽医局责成各生产企业及研究单位要尽快寻找替代本动物进行效力评价的方法。可见建立一种新型、有效、稳定、科学评价口蹄疫灭活疫苗效价体系迫在眉睫。

国际上主要采用密度梯度离心法检测有效抗原含量，我国采取本动物效力实验检测终端产品的方法对疫苗质量进行控制，但此方法存在成本较高和因动物个体差异导致的检测结果不准确等问题，且不能用于疫苗生产环节的中间品检验，因此建立快速有效的口蹄疫灭活疫苗抗原检测和定量方法极为重要。国际上采用的密度梯度离心法检测有效抗原含量的方法样品必须浓缩，过程比较复杂，最终导致的结果是检测结果不稳定，重复性差，而且周期长。

发明内容

本发明所解决的技术问题是利用经典的蔗糖密度梯度离心技术，将被检抗原直接加至蔗糖梯度顶部超速离心，再利用连续紫外检测器连续检测，根据抗原峰面积计算146S含量，从而达到快速、稳定检测口蹄疫灭活疫苗中间品或抗原146S的含量，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

口蹄疫灭活疫苗中间品或抗原146S含量的测定方法，包括以下步骤：

(1) 样品前处理，步骤如下：

1) 在无菌条件下将中间品或抗原样品分装于已灭菌管； 

2) 将分装后的中间品平衡后置于高速台式离心机内，在 4℃条件下离心5min；

3)吸取上清液即为试验用样品；

(2)将实验用样品直接用于蔗糖密度梯度离心，步骤如下：

1) 蔗糖密度梯度制备：使用自动梯度制备仪制备梯度，现制现用；

2)打开离心机进行自检测试，确保离心机可以正常运转；

3)测试完成后，打开舱门，将样品加入蔗糖梯度上层，用配制好的TNE缓冲液两两平衡，放入离心管内，拧紧离心管盖子，再将相应数字的离心管挂到水平离心管架上，放入离心机内，并记录样品号与相对应的离心管号后盖上离心盖，关闭舱门；

4)开始离心

离心参数如下：

转速为35000rpm/min

温度为10℃

时间为3h

5) 离心结束后，取出离心管，拧开离心管盖子，取出蔗糖梯度，弃掉1.5mL上层液体，将离心后的样品放置4℃待检；

(3) 通过使用连续紫外检测仪器，对离心后的样品进行连续检测: 在259nm波长下测定紫外吸光度,并根据紫外吸光度记录并保存检测曲线；