[发明专利]鸡新城疫病毒抗体水平相关的分子标记及其鉴别方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及鸡标记辅助选择技术领域，具体地说，是涉及用于鸡标记辅助选择的鸡新城疫病毒抗体水平相关的两种分子标记及其鉴别方法和应用。 

背景技术

新城疫是由新城疫病毒引起的严重危害家禽养殖的呼吸道传染病，新城疫病毒属于副粘病毒科。新城疫在我国各地均有发生，具有发病率和死亡率相对较高，成年蛋鸡产蛋率、蛋品质下降，饲料报酬低等危害，给养禽业带来了巨大的经济损失。目前在家禽养殖过程中都是通过接种疫苗来预防新城疫，但是随着新城疫疫苗免疫密度的提高和广泛应用，养殖成本进一步提升。同时，一些鸡群尽管按照免疫程序开展了新城疫疫苗防疫，但是由于病毒免疫应答水平存在个体差异，仍然会出现非典型鸡新城疫疫情。宿主对新城疫的抗性研究仍是一种挑战，我们前期利用鸡高密度单核苷酸多态性芯片进行全基因组关联分析发现与鸡新城疫病毒抗体水平密切相关的基因组区域，该基因组区域内的ROBO2基因上的突变与新城疫病毒抗体水平极显著相关。该基因是影响鸡对新城疫病毒免疫应答的候选基因。但目前从遗传的角度来说，还没有建立有关ROBO2基因作为鸡新城疫病毒抗体水平分子标记的检测方法，同时该基因作为鸡新城疫病毒抗体水平分子标记辅助选择也未见应用。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供鸡新城疫病毒抗体水平相关的分子标记及其鉴别方法和应用。 

本发明通过克隆与鸡新城疫病毒抗体水平相关基因ROBO2的cDNA全长序 列，寻找该基因编码区的突变位点以及相应的多态性检测方法，通过性状关联分析的应用，为鸡的标记辅助选择提供有用的分子标记。另外本发明还涉及分子标记的鉴别方法以及在鸡标记辅助选择上的应用。 

本发明克隆得到与鸡新城疫抗体水平相关基因ROBO2的全长cDNA序列，该全长cDNA序列包括完整的编码区序列及3’UTR和5’UTR，如序列表SEQ ID NO：1所述，该序列全长为5269bp。 

本发明通过对上述克隆所获得的cDNA片段分析，结果发现可作为鸡标记辅助选择应用的两种分子标记，这两种标记与鸡新城疫病毒抗体水平相关。 

分子标记一的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，在该序列的第50位的G碱基突变为A碱基；该突变位点位于鸡ROBO2基因的全长cDNA序列的1418bp处，如序列表SEQ ID NO：1所示。因此，为了方便表述，将标记一的G/A突变命名为1418G>A。 

分子标记二的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，在该序列的第167位碱基处T/C碱基突变。T碱基突变为C碱基，导致AluI-RFLP多态性；该突变位点位于鸡ROBO2基因的全长cDNA序列的2462bp处，如序列表SEQ ID NO：1所示。因此，为了方便表述，将标记二的T/C突变命名为2462T>C。 

分子标记一（1418G>A）：以鸡ROBO2基因的DNA序列（参考序列GeneBank登录号为NC_006088.3）为模板，设计引物扩增该基因部分序列。扩增所得到的序列包括部分第5外显子，如序列表SEQ ID NO：2所述，该序列全长为87bp。所用的引物为： 

RS-exon5-F：5'-AGGAGGAGGCCGTGGATTT-3'， 

RS-exon5-R：5'-TTGGCAGGTCTGCGTCAT-3'。 

分子标记二（2462T>C）：以鸡ROBO2基因的DNA序列（参考序列GeneBank登录号为NC_006088.3）为模板，设计引物扩增该基因部分序列。扩增所得到的序列包括完整的第12外显子和部分第11内含子、部分第12内含子，如序列表SEQ ID NO：3所述，该序列全长为286bp。所用的引物为： 

RS-exon12-F：5'-TTTACTTCCTTGTTTTCTTG-3'， 

RS-exon12-R：5'-ACCTTCAGTTTCTTTCTTTC-3'。 

本发明的第二个目的是提供了两种分子标记的鉴别方法。