[发明专利]一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及植物转基因培养技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法。

 

背景技术

转基因技术是指将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体性状的改变，是可遗传的修饰。植物转基因技术是植物学研究领域的重要方面，是研究特定目的基因功能和开发转基因植物的基础技术手段。一直以来，植物转基因技术是研究者关注的热点，随着研究的逐渐深入，转基因技术也日趋完善。

甘蔗是一种重要的糖料作物，甘蔗糖占我国食糖总量的90%以上。同时，甘蔗也是一种生物质能源作物，甘蔗作为目前栽培作物中光合效率最高、产量最高的高光效C₄作物，是生产乙醇的最佳能源作物。甘蔗遗传背景复杂，常规的杂交育种周期长，效率低下。转基因技术能够快速对现有品种进行定向改良，在甘蔗育种上有着广泛对应用前景。甘蔗转基因技术和其它植物相比，十分落后，直到上世纪九十年代才通过愈伤组织途径获得了转基因植株。目前，甘蔗转基因所常用的受体材料多为愈伤组织或胚状体。这两者都需要一定的时间进行愈伤组织的诱导，比较费时费力，同时受到再生体系建立困难的限制。

 

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明的在于提供一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法，利用处理后的甘蔗叶圆片为受体，通过农杆菌介导快速获得转基因甘蔗。

为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下：

一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法，其步骤如下：

1）农杆菌转化：将含有外源基因的农杆菌培养至对数生长期，收集菌体，重悬于含乙酰丁香酮的MS液体培养基中，得到转化菌液； 

2）干旱胁迫：取甘蔗末梢的叶片，酒精表面消毒后切成厚度为0.3～0.5cm的甘蔗叶圆片，在超净台上放置15～50分钟，进行干旱胁迫；

3）浸染：将步骤2）得到的甘蔗叶圆片浸泡在步骤1）制备的转化菌液中，将液体吸干后再将甘蔗叶圆片置于共培养培养基上，于25～30℃暗培养3～4天；

4）生根诱导：将上述经过浸染后的甘蔗胚性细胞置于选择培养基培养，进行再生；待苗高为2～3cm时，切取植株接到生根培养基进行生根诱导，得到生根的植株；

5）炼苗、移栽：将生根的植株炼苗、移栽，得到转基因甘蔗植株。

上述方法中，作为本发明的一种优选的方案，步骤1）的MS液体培养基中乙酰丁香酮的含量为100～250 μM。

本发明中，甘蔗叶圆片在超净台上处理的目的是让叶片失水，加大对叶片的伤害，以达到提高转化率的目的。

上述方法中，作为本发明的一种优选的方案，步骤3）的共培养培养基为MS培养基与2～5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、1～3mg/L 6-苄氨基嘌呤以及5.5 g/L 琼脂粉的混合培养基，其pH 5.5。优选的，在步骤3中浸泡的时间为10～15min。

上述方法中，作为本发明的一种优选的方案，步骤4）所述的选择培养基为MS培养基与2～5 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1～3 mg/L 6-苄氨基嘌呤、250mg/L 头孢霉素、5.5 g/L 琼脂粉的混合培养基以及抗性标记筛选物质，其pH 5.8；所述的生根培养基为MS培养基与2-5 mg/L萘乙酸、250mg/L 头孢霉素、5.5 g/L 琼脂粉以及抗性标记筛选物质的混合培养基，其pH 5.8。在本发明中步骤4）的培养基中加入抗性标记筛选物质的目的是让非转化的细胞死亡，含有外源基因的细胞正常生长所述抗性标记筛选物质为抗生素或除草剂，抗性标记筛选物质的加入量为：3-5mg/L。

上述方法中，作为本发明的一种优选的方案，步骤1）中农杆菌采用YEB液体培养基培养，具体步骤为：将含有外源基因的农杆菌接种于含抗生素的YEB液体培养基中，25～30℃摇床过夜，再按体积百分比1%接种量转接入50mL同样培养基中培养2～4小时至OD600为0. 5～0.6，收集菌体；然后用5mL含100μM AS的MS液体培养基重新悬浮沉淀，将菌液转入50mL含100μM AS的MS液体培养基中，28℃摇床上培养至OD600到0.5～0.6。

上述方法中，作为本发明的一种优选的方案，所述外源基因为草丁膦抗性基因。

优选的，在步骤4）中生根诱导的时间为4周。

上述方法中，作为本发明的一种优选的方案，步骤5）中移栽所用的基质为园土和泥炭土按质量比1：1混合。

先比现有技术，本发明的有益效果在于：