[发明专利]一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法，其步骤如下：

1）农杆菌转化：将含有外源基因的农杆菌培养至对数生长期，收集菌体，重悬于含乙酰丁香酮的MS液体培养基中，得到转化菌液； 

2）干旱胁迫：酒精表面消毒后切成厚度为0.3～0.5cm的甘蔗叶圆片，在超净台上放置15～50分钟； 

3）浸染：将步骤2）处理后的甘蔗叶片浸泡在步骤1）制备的转化菌液中，将液体吸干后再将甘蔗叶圆片置于共培养培养基上，于25～30℃暗培养3～4天；

4）生根诱导：将上述经过浸染后的甘蔗叶圆片置于选择培养基培养，进行再生；待苗高为2～3cm时，切取植株接到生根培养基进行生根诱导，得到生根的植株；

5）炼苗、移栽：将生根的植株炼苗、移栽，得到转基因甘蔗植株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）的MS液体培养基中乙酰丁香酮的含量为100～250μM。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）的共培养培养基为MS培养基与2-5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、1-3mg/L 6-苄氨基嘌呤以及5.5 g/L 琼脂粉的混合培养基，其pH 5.5。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）所述的选择培养基为MS培养基与2～5 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1～3 mg/L 6-苄氨基嘌呤、250mg/L 头孢霉素、5.5 g/L 琼脂粉的混合培养基以及抗性标记筛选物质，其pH 5.8；所述的生根培养基为MS培养基与2～5 mg/L萘乙酸、250～500mg/L 头孢霉素、5.5 g/L 琼脂粉以及抗性标记筛选物质的混合培养基，其pH 5.8。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述抗性标记筛选物质为抗生素或除草剂。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中农杆菌采用YEB液体培养基培养，具体步骤为：将含有外源基因的农杆菌接种于含抗生素的YEB液体培养基中，25～30℃摇床过夜，再按体积百分比1%接种量转接入50mL同样培养基中培养2～4小时至OD600为0. 5～0.6，收集菌体；然后用5mL含100μM AS的MS液体培养基重新悬浮沉淀，将菌液转入50mL含100μM AS的MS液体培养基中，28℃摇床上培养至OD600到0.5～0.6。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述外源基因为草丁膦抗性基因。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5）中移栽所用的基质为园土和泥炭土按质量比1：1混合。