[发明专利]一种检测液体中内毒素含量的方法有效
申请号: | 201310712306.5 | 申请日: | 2013-12-20 |
公开(公告)号: | CN103675051A | 公开(公告)日: | 2014-03-26 |
发明(设计)人: | 缪鹏;王弼陡;罗刚银;钱庆;王钟周;程文播 | 申请(专利权)人: | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 |
主分类号: | G01N27/26 | 分类号: | G01N27/26 |
代理公司: | 北京远大卓悦知识产权代理事务所(普通合伙) 11369 | 代理人: | 史霞 |
地址: | 215163 江*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 检测 液体 内毒素 含量 方法 | ||
技术领域
本发明涉及内毒素的检测技术领域,特别涉及一种检测液体中内毒素含量的电化学分析方法。
背景技术
内毒素是由多糖、脂质和蛋白质组成的复合体,是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分之一。当细菌破裂后,内毒素会释放出来,环境中到处存在内毒素。内毒素能引起发热反应,白细胞反应,内毒素血症、内毒素休克和弥散性血管内凝血。因此内毒素检测在环境监测、药厂质量控制、医疗器械热原监测等领域具有十分重要的意义。
内毒素具有以下性质:稳定性强,具有耐热性;抗原性弱,免疫动物后,形成的抗体较少。目前内毒素检测方法主要有两种,包括家兔检测热源法和鲎试验法。随着制药工业的发展,热原法已不能适合许多品种的热原检查。鲎试验因其简单、快速、灵敏、准确的特点,被世界各国广泛采用,中国药典和欧美药典将其定为法定的细菌内毒素检查法。目前鲎试验检测法试剂盒有以下几种:
(1)凝胶法鲎试剂(定性,半定量)
(2)动态浊度法鲎试剂(定量)
(3)终点浊度法鲎试剂(定量)
(4)动态显色法鲎试剂(定量)
(5)终点显色法鲎试剂(定量)
鲎试验检测法的检测容易受到样品中显色物质的干扰,而且鲎试剂的凝固过程对光学测量也有一定干扰,此外,鲎试剂反应中G因子旁路也会对检测的特异性造成影响。利用鲎这种珍稀动物制备鲎试剂成本较高,并且会造成一定程度的生态破坏,基于以上一些因素,鲎试验的广泛应用有一定的局限性,对内毒素的检测需要开发新型的传感策略。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测液体中内毒素含量的方法,本发明所述方法对内毒素的检测具有快速、选择性强、灵敏度高等特点。
本发明提供一种检测液体中内毒素含量的方法,包括以下步骤:
步骤1)将含饱和鲎C因子的水溶液加入到待测液体中,得到一混合液,待测液体中的内毒素能够激活所述鲎C因子,产生活性鲎C因子;
步骤2)将经过修饰的电极插入到所述混合液中,电极表面与所述活性鲎C因子发生酶切反应,电极表面的电化学性质被改变;随后取出电极,插入到另一含电化学活性物质的电解液中,测该电极对所述电解液的电化学响应值;
步骤3)配制至少三个含特定浓度的内毒素标准液,按照步骤1)和2)进行操作后得到相应的至少三组电化学响应值,并将所得电化学响应值绘成标准曲线;将步骤2)中所得电化学响应值与所述标准曲线进行比对,从而得出所述待测液体的内毒素含量;
步骤1)中所用鲎C因子是采用基因重组的方法制得。
优选地,所述的检测液体中内毒素含量的方法,步骤1)中所用鲎C因子是采用以下方法制得:从鲎的血液中提取出RNA,逆转录出鲎C因子的DNA,在原核表达系统或真核表达系统中重组表达出鲎C因子,并对重组表达出的鲎C因子进行纯化。
优选地,所述的检测液体中内毒素含量的方法,重组表达出的鲎C因子采用透析法、超滤法、盐析法、密度梯度离心法、电泳法、离子交换层析法、亲和层析法或低温有机溶剂沉淀法中的任意一种方法进行纯化。
优选地,所述的检测液体中内毒素含量的方法,步骤2)中所用电极在插入到所述混合液之前,电极表面修饰有包含鲎三肽的多肽序列。
优选地,所述的检测液体中内毒素含量的方法,所述多肽序列所含氨基酸数量为5~50个;所述多肽序列配成溶液修饰到电极表面上,所述多肽序列的浓度为0.1μM~100mM;修饰电极的方法采用吸附固定法、共价键合法或交联法中的任意一种。
优选地,所述的检测液体中内毒素含量的方法,所述电极为金电极或碳电极。
优选地,所述的检测液体中内毒素含量的方法,所述电解液中电化学活性物质选自铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌或其配合物、吩恶嗪衍生物或具有电化学性质的纳米材料中的任意一种,所述电解液中电化学活性物质的浓度为0.1mM~100mM。
优选地,所述的检测液体中内毒素含量的方法,测试电化学响应所用方法选自循环伏安法、计时电量法或示差脉冲伏安法中的任意一种。
优选地,所述的检测液体中内毒素含量的方法,所述电极表面的反应温度为37.0±1℃,所述酶切反应的反应时间为10min~3h。
本发明的有益效果是:通过电化学过程检测出内毒素的浓度,不受样品颜色的干扰,不使用鲎试剂,有效地降低了成本,缓解了部分生态压力,还避免了传统鲎试剂反应中G因子旁路的干扰。同时,使用基因工程的方法,保证了检测方法中试剂批次间的均一性,有利于产业化生产,适合于环境监测、药厂质量控制、医疗器械热原监测等领域。
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