[发明专利]一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗及其制备与应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗及其制备与应用。 

背景技术

迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是一种革兰氏阴性杆菌，能感染鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类。该菌是淡水和海水养殖鱼类和野生鱼类的重要病原菌之一，引起出血性败血症，造成世界范围鱼类养殖的重大经济损失。在我国，迟缓爱德华氏菌不仅感染甲鱼、鳗鲡、罗非鱼等淡水养殖品种，还感染鲈鱼、牙鲆、大菱鲆、舌鳎、美国红鱼、大黄鱼、石斑鱼、真鲷等重要海水养殖品种，对我国水产养殖危害巨大。当前迟缓爱德华氏菌病的防治主要依靠抗生素类药物，由于抗生素带来的生态、环境以及食品安全等的不良影响，其在水产养殖的应用在国内外受到很多限制。免疫防治是国际上普遍认可的安全有效的防治疾病的方法，国内外已针对迟缓爱德华氏菌病开展了多种疫苗研制，包括灭活疫苗、亚单位疫苗、弱毒疫苗、核酸疫苗以及载体疫苗，但目前尚未有商业化疫苗。亚单位疫苗是利用病原体的蛋白成分研制的一种疫苗，能够激发宿主强烈的特异性免疫应答，因而一直是医学和畜牧兽医界的重点研发领域。 

发明内容

本发明目的在于提供一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗及其制备与应用方法。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 

一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗，疫苗蛋白基因具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。 

疫苗蛋白基因编码蛋白为具有序列表SEQ ID No.2中的氨基酸序列。 

一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的制备, 

1）质粒pETD的构建：以迟缓爱德华氏菌LSE40的基因组DNA为模板，用引物EDF和EDR进行PCR扩增，产物纯化后用BamHI/HindIII双酶切，回收579bp片断；同时将质粒pET30用BamHI/HindIII双酶切，回收5.4kb片断；将上述回收的两个DNA片断用T₄DNA连接酶连接，连接液转化感受态大肠杆菌DH5α后涂布含卡那霉素的LB固体培养基，筛选转化子提取质粒，即为质粒pETB； 

所述引物为：EDF：5’-GCGCGGATCCGACGACTATCGACAGCGGCAG-3’和EDR：5’-GCGCAAGCTTGGACATGCGTACGCTGCT-3’； 

2）疫苗蛋白的诱导表达和纯化：将质粒pETD转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，筛选得到携带pETD的菌株BL21/pETD；将BL21/pETD在含卡那 霉素的LB液体培养基于37℃培养12-16小时，所得培养液按体积比1:100的比例转接新鲜的LB液体培养基，于37℃培养OD₆₀₀至0.5-0.8，加入IPTG至终浓度为1mmol，并继续培养3-5小时，离心收集菌体并悬浮于PBS中，用超声波裂解菌液至澄清；将裂解液离心并回收上清；将上清液用凝胶柱回收，即得具有序列表SEQ ID No.1碱基序列编码的氨基酸序列的亚单位疫苗蛋白。 

将上述所得的亚单位疫苗蛋白在PBS稀释至200-300μg/ml，之后将稀释的疫苗蛋白与油乳佐剂等体积混合。 

一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的应用，所述疫苗用于制备抵抗迟缓爱德华氏菌侵染的疫苗。 

将所述油乳疫苗腹腔注射于鱼内，14天后加强免疫一次，免疫鱼即可产生针对疫苗蛋白的特异性抗体，并获得抵抗迟缓爱德华氏菌侵染的能力。 

本发明所具有的优点为：本发明所得的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗能诱导鱼体产生高的特异性免疫应答反应，获得高的免疫保护率。此外，本发明应用方法简单，配以油乳佐剂即具有高效免疫增强作用。 

附图说明

图1为本发明亚单位疫苗蛋白在大肠杆菌的诱导表达及纯化疫苗蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中，1为蛋白分子量标准，2为未加IPTG诱导的细菌，3加入IPTG诱导的细菌，4为经镍凝胶柱回收的蛋白。 

图2为本发明亚单位疫苗蛋白在大肠杆菌的诱导表达及纯化疫苗蛋白的免疫印迹图。其中，1为未加IPTG诱导的细菌，2为加入IPTG诱导的细菌，3为经镍凝胶柱回收的蛋白。 

具体实施方式

现参照下列实施例对本发明作进一步说明，实施例对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。 

实施例1 

迟缓爱德华氏菌疫苗表达载体的构建方法：