[发明专利]一种催化碳-氟和碳-氯键形成的卤化酶

说明书

 

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及通过基因重组技术获得具有催化C-F键和C-Cl键形成的卤化酶。

背景技术

卤化酶是一大类能催化卤素离子（包括F^-，Cl^-，Br^-，I^-）形成稳定碳卤键的酶，从催化的机制来分可以分为血红素依赖、黄素依赖、酮戊二酸依赖、钒依赖以及SAM依赖的卤化酶（C. T. Walsh, Chemistry & Biology, 2008, 15, 99-109），其中又以能催化形成C-F键的卤化酶尤为重要。

有机氟化合物被广泛应用于药物，医学检测，农药以及材料，在药用化合物中引入氟原子往往能提高药物的活性及稳定性。据统计，大约有20 %-30 %的商品药含有氟原子(T. Furuya, et al., Nature, 2011,473, 470-477)，因此，有机含氟化合物越来越被人们所重视。然而，自然界中存在的含氟有机物数量少之又少，只在非洲大陆的少数植物和链霉菌Streptomyces cattleya体内发现少量的高毒含氟化合物。究其原因，是因为在自然界中，CaF₂等含氟无机物溶解性很差，绝大多数是以沉淀的形式存在，因此，氟元素不能被生命体很好的利用。当前，仅仅依靠所发现的极少量的天然含氟有机化合物，是远远不能满足生产和生活的需求的。尽管过去几十年，人们已经开发出一些化学合成有机含氟化合物的方法，但由于氟原子的特殊化学性质，使得这些方法往往要在苛刻、高毒的化学环境中才能完成有机化合物的氟化，而且选择性也不尽人意。

与化学合成相比，酶催化合成的具有催化条件温和，选择性高，绿色环保等优点。目前，酶催化技术已经被广泛应用于化学品，医药中间体的生产。其发展潜力巨大。目前，已知催化氟离子形成C-F键的卤化酶（fluorinase，E.C.2.5.1.63）仅有一例：2002年，O’Hagan等人报道了从链霉菌S. cattleya分离的卤化酶FlA能催化F^-和SAM形成5’-FDA(O’Hagan, et al., Nature, 2001, 416, 279)。通过进一步对FlA纯化和晶体解析，该研究表明，连接N端和C端的环形区域（loop）为F^- 和SAM提供反应所必须的空间区域。FlA第158位的丝氨酸残基对F^-的结合和去溶剂化起到了关键的作用，使得F^-能够选择性亲核进攻SAM的5’位，形成5’-FDA。

发明内容

    本发明所要解决的技术问题在于提供一种催化碳-氟和碳-氯键形成的卤化酶。

为达到上述目的，本发明采用以下技术手段：

首先，以来源于巴西诺卡菌的卤化酶基因为原始基因，根据卤化酶基因在大肠杆菌体内表达的密码子偏好，进行优化，合成以大肠杆菌为表达宿主的优化卤化酶基因序列；

其次，将优化卤化酶基因序列重组到克隆载体pUC57 simple，经NdeI和HindⅢ 双酶切之后，连接到具有同样内切酶位点的表达载体pET28a(+)片段上，获得表达载体pWHU2401；

最后，将表达载体pWHU2401转化大肠杆菌感受态细胞，获得能够异源表达卤化酶的工程菌，放大发酵，纯化，从而获得卤化酶。

本发明还对获得的卤化酶的性能进行了测定，包括最适pH，米氏常数K_m，转化常数k_cat和对除F^-以外的其他卤素离子的活性。测定结果显示，我们获得的卤化酶能够特异性合成5’-氟5’-脱氧腺嘌呤核苷（5’-FDA），催化活性跟已知的卤化酶FlA活性相当。在加入L-氨基酸氧化酶时，该卤化酶也能催化形成5’-氯-5’-脱氧腺嘌呤核苷（5’-ClDA）。

本发明中，我们利用基因工程的方法，克隆了来源于巴西诺卡菌的新颖卤化酶基因nobA，通过蛋白表达我们获得了高活性的卤化酶，体外活性测试证实了其能催化氟离子和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）形成5’-FDA（图2）。此外，在氨基氧化酶的存在下，我们发现，NobA还可以催化氯离子和和SAM形成5’-ClDA（图5）。这一发明报道了有史以来的第二例催化碳-氟键形成的卤化酶，填补了国内关于这类酶研究的空白。

附图说明