[发明专利]一种针对镰刀菌的多重PCR检测的引物及其应用

说明书

技术领域

    本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种鉴定镰刀菌的引物序列及其应用。

背景技术

   玉米是重要的粮食作物和饲料来源，穗腐病是玉米生长后期最常见的病害之一，在各玉米产区均有发生，由多种病原菌引起。镰刀菌是引起玉米穗腐病的主要病原菌，不仅给玉米生产造成巨大的经济损失，镰刀菌在致病过程中积累的真菌毒素还降低玉米的品质，给食品安全和饲料安全造成严重威胁。

在不同气候带的玉米产区中，引起玉米穗腐病的镰刀菌种群结构不同。在欧洲中东部，玉米穗腐病的主要致病菌是禾谷镰刀菌Fusarium graminearum，轮枝镰刀菌F. verticillioides则遍布整个欧洲，其他的一些镰刀菌也会引起玉米穗腐病，包括F. subglutinans,  F. proliferatum和F. culmorum。在中国，引起玉米穗腐病的镰刀菌种群主要包括禾谷镰刀菌F. graminearum，轮枝镰刀菌F. verticillioide和层出镰刀菌F. proliferatum，其中轮枝镰刀菌F. verticillioide为优势种群，禾谷镰刀菌F. graminearum其次，层出镰刀菌F. proliferatum也经常有检出。由于不同的镰刀菌产生的真菌毒素的种类不一样，再加上传统的形态学检测方法耗时费事，因此，急需通过多重PCR检测的引物建立一种快速简便且能一次准确区分这三种不同镰刀菌的检测方法对于玉米穗腐病的种群分布和动态分析奠定理论基础，为该病害的综合治理提供科学依据。

此外，禾谷镰刀菌F. graminearum还是引起麦类作物赤霉病的主要病原菌，因此多重PCR检测的引物还可以直接用于检测引起麦类作物赤霉病的病原菌。

发明内容

   本发明的目的在于，为同时检测禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌和层出镰刀菌，基于不同镰刀菌编码的酮酸-还原异构酶的ILV5基因和编码甾醇24-C还原酶的ERG24B基因的碱基差异，提供一种用于多重PCR检测的引物及其应用。

    本发明目的是这样实现的：

    一种针对镰刀菌的多重PCR检测的引物，其特征在于：多重PCR检测的引物由三组引物对组成，它们分别是序列号为SEQ ID No.1的Fg-F和序列号为SEQ ID No.2的Fg-R，序列号为SEQ ID No.3的Fv-F和序列号为SEQ ID No.4的Fv-R，以及序列号为SEQ ID No.5的Fp-F和序列号为SEQ ID No.6的Fp-R。

   本发明中，所述多重PCR检测的引物在针对禾谷镰刀菌（F. Graminearum）、轮枝镰刀菌（F. Verticillioide）和层出镰刀菌（F. Proliferatum）检测中的应用。

   本发明中，所述的应用，其具体步骤为：

a) 提取待检测菌株的DNA；

b) 多重PCR扩增：以待检测菌株的DNA为模板进行多重PCR扩增；

多重PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μl，4.5U Taq酶、dNTPs 0.2 μM、MgCl₂ 2 mM、DNA模板2 μl、引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6各0.07 μM，最后加灭菌双蒸水至25μl；

多重PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性25 s、60℃退火25 s、72℃延伸25 s，共30个循环；72℃延伸10 min，10℃保存；

c）1.5%（w/v）的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，经含有1%（w/v）的EB染色液染色后，观测凝胶中DNA条带大小，扩增得到885-bp DNA条带为禾谷镰刀菌，扩增得到416-bp DNA条带为轮枝镰刀菌，扩增得到220-bp DNA条带为层出镰刀菌。