[发明专利]一种编码巯基-二硫键氧化还原酶基因的应用

说明书

本发明披露了一种编码巯基‑二硫键氧化还原酶基因在黄原胶生产中的应用。该基因用于构建及选育黄原胶高产的基因工程菌。该基因工程菌携带该基因的重组质粒pL0495，通过将pL0495导入野油菜黄单胞菌野油菜变种的野生型菌株8004获得。本发明鉴定了Xcc8004菌株基因组中编码巯基‑二硫键氧化还原酶基因与黄原胶产量有关，该基因可用于构建、选育黄原胶高产的基因工程菌株。

技术领域

本发明涉及微生物遗传工程技术，尤其涉及一种编码巯基-二硫键氧化还原酶基因在改良黄原胶高产菌株中的应用。

背景技术

黄原胶(Xanthan gum)是一种由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas oampestris)所产生的胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)聚合物，由多个“五糖单元”聚合而成。两个D-葡萄糖分子通过β-(1→4)糖苷键连接成主链骨架，一条由甘露糖-(β→1，4)-葡萄糖醛酸-(β→1，2)-甘露糖组成的侧链通过α-(1→3)糖苷键连接到主链的一个D-葡萄糖残基，组成一个“五糖单元”(Swings & Civerolo，l993)。“五糖单元”例链的甘露糖残基不同程度地被乙酰化或丙酮酰化。不同来源的菌株和不同培养条件所产生的黄原胶的结构基本相同，但侧链的酰基化程度不同，因而乙酸和丙酮酸的含量不同，黄原胶的质量也就不同(Cadmus et al.，1976；Stankowski et al.，1993)。工业生产上通常采用野油菜黄单胞菌野油菜变种(Xanthomonas campestris pv.campestris，简称Xcc)作为生产菌种进行发酵生产黄原胶。

黄原胶是目前仅次于抗生素和溶剂的第三大类发酵产品，具有良好的假塑性和流变性，被作为悬浮剂、增稠剂、乳化剂等广泛应用于二十多个工业行业的一百多种产品的生产中。目前全球对黄原胶的年消耗量超过5万吨，并且每年仍以10％的速度增长(Becker etal.，1998；Garcia-Ochoa et al.，2000；Swings & Civerolo，1993)。

由于黄原胶具有巨大的商业价值，其生物合成机理的研究从上世纪八十年代起在国际上就受到人们的重视，已发现黄原胶合成的一些重要途径和所需的酶系统。目前已鉴定Xcc染色体上有三簇基因与黄原胶合成有关：参与糖核苷等衍生物前体形成的一个35.3kb的基因簇(Harding etal.，1993；1992)，参与“五糖单元”的顺序性组装、残基修饰、重复单元间的聚合以及黄原胶分泌的gum基因簇(Harding et al.，1987；Ielpi et al.，1993)，以及一个包含三个基因但在黄原胶合成过程的具体作用尚未十分清楚的基因簇(Lu et al.，2007)。尽管人们已对黄原胶的生物合成机理作了较多的研究，但有关黄原胶生物合成的调控、影响黄原胶生物合成的产量和质量的其他代谢途径等问题仍尚未十分清楚。

黄原胶在我国的研究开发始于八十年代，并于八十年代末实现了国产黄原胶的工业化生产。但是，国产黄原胶与国外产品相比，生产成本高、产品质量差，不具备与国外产品竞争的能力。目前国外产品在国内黄原胶市场仍占很大的份额，并随着国内黄原胶市场需求的增加其市场份额有逐渐增加趋势。改良黄原胶生产菌株、提高黄原胶产量和质量，是我国黄原胶生产面临的主要问题。发达国家黄原胶生产菌株的黄原胶产量比国内的生产菌株往往高出20％以上。另外，在黄原胶的粘度、抗盐性和对酸碱热的稳定性等质量指标方面，国外产品也比国内产品要高。因此国内黄原胶生产企业迫切需要优良的黄原胶生产菌株和新的生产工艺。由于采用传统的育种方法改良菌种效果有限，故人们寄望于采用现代遗传工程手段来定向改良菌种。鉴定和克隆与黄原胶生物合成相关的基因，将可为通过遗传工程改良菌种或设计新工艺提供工作基础。