[发明专利]猪呼吸与繁殖综合征病毒复制缺陷性病毒疫苗株的构建及应用

说明书

技术领域

本发明属于疫苗制备领域，具体涉及一种利用Nsp9基因缺失构建PRRSV（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，猪呼吸与繁殖综合征病毒）复制缺陷性病毒疫苗株的方法及其在疫苗生产方法中的应用。 

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是20世纪80年代末发现的一种高度传染性疾病，引起妊娠母猪的流产、死胎、木乃伊胎等生殖障碍，以及各种年龄猪（特别是仔猪）的呼吸道疾病。1987年美国首先报道了该病的发生。随后短短几年时间内，迅速遍及全球各养猪业发达的国家和地区。1996年，哈尔滨兽医研究所首次从国内疑似PRRS病例中分离到PRRS病毒，从而证实了本病在我国的存在。1991年，Lelystad的荷兰中央兽医研究所的Wensvoort博士用猪肺泡巨噬细胞首次分离到病原，并命名为Lelystad病毒（PRRSV欧洲型代表株）。1992年美国研究人员用CL2621细胞也分离到PRRSV美洲型代表株（VR-2332）。通过对这种病毒的形态、结构和抗原性等的研究，证明其为一种新发现的病毒。 

其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），属于新成立的尼多病毒目（order Nidovirales）、动脉炎病毒科（family Arteriviridae）、动脉炎病毒属（genus Arterivirus）。PRRSV不同分离株核苷酸序列存在广泛而明显的变异，依据血清学试验及结构基因序列分析结果可将PRRSV划分为两种基本的基因型：欧洲型（Ⅰ型）和美洲株（Ⅱ型），前者主要流行于欧洲地区，而后者主要流行于美洲和亚太地区。但丹麦、斯洛伐克、加拿大已分别出现了两型PRRSV的感染。并且，丹麦发生的美洲型PRRSV的流行是由于美洲型PRRSV弱毒苗毒力返强的结果。虽然二个基因型的基因组核苷酸一致性仅55%～70%，但其形态结构、复制特点、细胞嗜性、流行传播方式及其引发的疾病特征等生物学特性均相同。 

我国自2006年以来，由PRRSV变异株引起的“猪高致病性蓝耳病”是一种新型烈性传染病，它以流行广、传播快、发病率和致死率高、现行疫苗无保护作 用为特征，而与经典猪蓝耳病截然不同，截止目前，本病已在我国20多个省份流行，最近我省部分中小猪场也未能幸免，沉重地打击了我国我省的养猪业，其经济损失已达到亿万元计。2008年高致病性猪蓝耳病在全国的流行较少，但2009下半年开始又出现了高致病性猪蓝耳病的爆发流行，在我国的北方省份如河南、安徽、山东等流行严重，造成了很大的经济损失。 

在PRRSV中，ORF1是最大的1个阅读框，长约12kb，包括ORF1a和ORF1b，约占病毒基因组的80%，为病毒的非结构蛋白编码区，Nsp9基因位于ORF1b上主要编码RNA依赖性的RNA聚合酶（RNA－dependent RNA polymerase，RdRp），参与病毒复制过程，高度保守。Nsp9的生物学功能与病毒的生物学以及临床特征有何关系尚不清楚。反向遗传技术为研究RNA病毒的复制、致病性、蛋白功能、病毒与宿主的相互作用以及开发新型疫苗和病毒载体提供了一个很好的技术平台。Siao-Kun Wan Welch等构建了分别缺失ORF2和ORF4的PRRSV复制缺陷性病毒疫苗株，但免疫猪后只产生较弱的免疫反应（Welch,S.K.,et al.,Construction and evaluation of genetically engineered replication-defective porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine candidates.Vet Immunol Immunopathol,2004.102(3):p.277-90.）。 

猪繁殖与呼吸综合征（或猪蓝耳病）疫苗的研发是一个世界性难题，活疫苗普遍存在毒力偏强的问题，而灭活疫苗存在的主要问题是免疫效力欠佳。尽管目前针对PRRS的疫苗研究种类繁多，但没有一种疫苗可对猪体产生理想的安全保护作用。因此当前迫切需要研究出一种安全有效，免疫谱广的疫苗。 

发明内容