[发明专利]一种高效表达人生长激素的重组工程菌及构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物工程领域，尤其是一种高效表达人生长激素的重组工程菌及构建方法和应用。 

背景技术

人生长激素(human growth hormone，hGH)，又称为促生长素(somatotorpin)，是由191个氨基酸组成的亲水性单链球蛋白，其相对分子质量在22kD左右，等电点P1为4.9，分子中存在两对二硫键。hGH是由人脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种重要的非糖基化蛋白质激素。脑垂体在下丘脑生长激素释放因子的刺激下，便能释放生长激素，而生长激素抑制素则能抑制它的释放。生长激素是通过血液运输到靶组织，影响几乎所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统。其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化；调节蛋白质、糖及脂肪的代谢等，临床上主要用于治疗侏儒症，近年来研究发现hGH还可治疗烧伤、创伤、骨折、骨质疏松等多种疾病。大量研究证实，生长激素缺乏是导致儿童生长障碍重要的因素之一。hGH的受体遍及人的全身。hGH的作用机理一般认为是通过cAMP进行的，在与靶细胞膜上特异性受体结合后，改变氨基酸及代谢产物的转运，诱导某些特异性蛋白质和核酸的合成。 

生长激素的种属特异性很强，不同物种的生长激素的差别很大。传统临床应用的生长激素是从人脑的垂体中提取的，价格昂贵无法推广，一个人的垂体中最多只能提取出3～5mg的人生长激素。20世纪80年代之后，分子生物学的出现带动了生产重组蛋白的发展，使得利用基因工程的方法大规模生产HGH成为可能。这样可以得到与天然人生长因子相似或者完全一致的基因工程药物。 

1985年美国FDA首次批准基因技术生产的重组hGH用于临床治疗和使用，其需求量和销售额在基因工程药物中排前列。90年代，人们开始用哺乳类细胞合成重组人生长激素(191肽)，该制剂的氨基酸序列与人天然生长激素完全一致，因为它是在哺乳细胞中合成，而非大肠杆菌，故无污染的危险，同时减少了抗原性。近年来，人们又不断尝试利用多种表达系统比如昆虫细胞、蚕、转基因小鼠、家兔、山羊、牛等表达人生长激素，但存在表达量不高，工艺复杂、发酵后处理繁琐、难以工业化生产等问题。毕赤酵母作为低等真核生物，具有高效分泌表达的特点，同时可以利用自身信号肽的切割的特点，获得无Met的人生长激素。 

传统的利用大肠杆菌表达重组hGH，有两种不同的技术途径，一种是生产分泌型 的hGH，一种则是生产胞内型。经实践验证，生产分泌型的hGH，虽然步骤简单，杂蛋白干扰较少，氧化型的环境利于蛋白折叠，但是其表达量很低，一般要和胞内型要差1个数量级以上。但是生产胞内型的蛋白却又存在工艺步骤复杂、杂蛋白干扰较多等缺点。此外，采用上述两种方法所得到的人生长激素还存在活性低、纯度低等缺点。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有利用大肠杆菌表达重组hGH的方法均存在各自不同的缺点以及得到的hGH活性低、纯度低等问题，提供一种高效表达重组hGH的重组工程菌及构建方法和应用。 

本发明是采用如下技术方案实现的：设计改造了大肠杆菌耐热肠毒素信号肽，并以此信号肽与大肠杆菌碱性磷酸酶启动子(phoA启动子)和大肠杆菌T7终止子组合作为表达调控元件使重组hGH在大肠杆菌中得以高效分泌表达，为最终开发低成本hGH药物制品奠定基础。 

在本发明的第一方面，提供了一种表达重组hGH的大肠杆菌操纵子，其结构包括：大肠杆菌碱性磷酸酶启动子（phoA启动子）、经过优化改造的大肠杆菌耐热肠毒素信号肽（heat-stable enterotoxin signal peptide）的编码序列（Seq ID NO:1）、优化的重组人hGH的编码序列（Seq ID NO:2）和大肠杆菌T7终止子（T7terminater）。 

构建所述大肠杆菌操纵子的方法，包括以下步骤：根据hGH全长序列设计引物，并替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以获得优化的基因序列；改造大肠杆菌耐热肠毒素信号肽并以选出的大肠杆菌耐热肠毒素的信号肽作为前导肽引导hGH的表达。上述步骤中，替换掉hGH全序列中大肠杆菌不利表达的密码子所得到的优化基因序列hGH如SEQ ID NO：2所示； 

GCATTCCCAA CTATACCACT AAGTCGACTA TTCGATAACG CTATGCTTCG 

GGCCCATCGT CTTCATCAGC TAGCCTTTGA CACCTACCAG GAGTTTGAAG 

AGGC CTATATCCCC AAGGAACAGA AGTATTCATT CCTGCAGAAC 

CCCCAGACCT