[发明专利]一种高效表达人生长激素的重组工程菌及构建方法和应用

权利要求书

1.一种表达重组人生长激素（rhGH）的大肠杆菌操纵子，其结构包括：大肠杆菌碱性磷酸酶启动子、经过优化改造的大肠杆菌耐热肠毒素信号肽（heat-stable enterotoxin signal peptide）的编码序列、优化的重组人hGH的编码序列（Seq ID NO:2）和大肠杆菌T7终止子。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌操纵子，其特征在于包含的经过优化改造的大肠杆菌耐热肠毒素信号肽的编码序列如下所示:ATGAAAAAGAATATCGCATT TCTTCTTGCA TCTATGTTCG TTTTTTCTAT TGCTACAAATGCCTAT（Seq ID NO:1）。

3.根据权利要求1所述的大肠杆菌操纵子，其特征在于，利用大肠杆菌碱性磷酸酶启动子调控权利要求2所述的信号肽引导的hGH分泌表达。

4.含有权利要求1所述的大肠杆菌操纵子的大肠杆菌质粒，其特征在于，将权利要求1所述的操纵子克隆至携带任意复制子（包括pMB1、P15A、ColE1和pSC101复制子）的大肠杆菌质粒载体中，发挥分泌表达重组hGH的作用。

5.根据权利要求4所述的大肠杆菌质粒，其特征在于，所述大肠杆菌质粒为pET22b(+)-rhGH。

6.大肠杆菌（Escherichia coli）菌株QJSW-SZ01，2013年2月26日保存于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.：7258。

7.能够高效分泌表达重组hGH的工程菌，其特征在于，为权利要求4或5所述的表达质粒转化的抗性适合的大肠杆菌空宿主，包括DH5α、JM109、JM109(DE3)、BL21、BL21(DE3)及其衍生株、Rosetta、Rosetta(DE3)及其衍生株、W3110、YK537、C41(DE3)和C43(DE3)。

8.一种生产重组hGH的方法，包括以下步骤：

(a)通过LB培养基和改良种子培养基进行工程菌的活化和扩增，在适当的罐内培养基及补料方式，培养参数控制条件下表达重组hGH；

(b)通过低温高速离心或超滤方式获得含人hGH的菌体。

9.根据权利要求8所述的方法，所述的表达载体是含IPTG诱导的启动子的表达载体pET22b(+)-rhGH，所述的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。

10.根据权利要求8所述的方法，在步骤(a)中进行高密度发酵；所述的步骤(b)包括步骤：

(i)采用冻融破碎发酵菌体，低温高速离心弃沉淀收上清；

(ii)通过盐析和或超滤对破菌液上清液进行初步纯化；

(iii)柱层析采用：阳离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析及其组合。