[发明专利]一种高通量细胞毒性评估方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种化学物质细胞毒性的测定技术，具体说是涉及一种基于无侵入、无标记、高通量实时细胞分析仪的细胞毒性测定系统及其细胞毒性评估新方法，属于细胞基因毒性分析领域。

背景技术

细胞毒性是指由化学物质引起的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。化学物质的细胞毒性测试，对人类健康风险评估、药物筛选、食品添加剂的安全测试，以及农药的毒性检定都具有重要的意义。目前，有很多技术可以实现化合物的细胞毒性测定，如：MTT、XTT法（利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测），LDH方法（通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性）。尽管这些方法可以实现细胞毒性测定，但存在诸多弊端，（1）大部分方法的测定程序繁琐，无法实现高通量筛选（High Throughput Screening，HTS）；（2）中性红染料染色对靶细胞也存在干扰，测定结果不易校正；（3）受到细胞培养皿体积限制，高通量筛选（High Throughput Screening，HTS）比较困难；（4）现有的细胞毒性评估方法采用终点法，忽略了靶细胞在暴露过程中的动态响应过程，从而导致评估结果受测定时间点的选取影响较大，例如：在细胞暴露24小时的评估结果可能完全不同于细胞暴露后48小时的评估结果。

美国专利No.6,982,1152提供了一种细胞毒性的评估方法，该方法将靶细胞暴露在一定浓度的待测化合物中，并加入具有两种状态的中性红染料，系统自动检测该染料的状态，并减去背景值，即可得到由待测化合物所引起的细胞死亡数量，从而实现该待测化合物的细胞毒性评估。该方法采用单器皿测定，无法实现高通量，且利用终点法计算细胞毒性指标，无法得到细胞在暴露期间的动态响应信息。

美国专利No.7,202,081提供了一种检测细胞增殖抑制技术，与其待测化合物细胞增殖抑制活性的筛选方法。该方法采用传统的IC₅₀评估待测化合物细胞毒性大小，忽略了细胞在暴露期间的动态响应信息，导致检测结果受到测定时间点的选取影响较大。因此，无法确定哪个时间点（比如：24小时或者48小时）是最佳的、或是有效的。此外，该方法使用荧光法确定细胞的数目，而荧光强度受pH值和温度波动影响较大，检测信号不容易校正。

发明内容

本发明针对上述不足，提出一种结合实时细胞分析仪（Real Time Cell Analyzer，RTCA）的细胞毒性评估方法，实现对多个待化合物细胞毒性的测定，并为评估各种化合物对细胞死亡，或增殖抑制的影响提供依据，以满足人类健康风险评估的需求。同时，体外细胞毒性分析，也有利于确定体内急性毒性最适宜的开始剂量，大大减少实验动物的使用。

依据本发明的目的，提出一种高通量细胞毒性测定系统，该系统包含一用于监测细胞生长和控制其生长环境参数的PC机/笔记本电脑，一用于维持细胞生长环境的细胞培养箱（incubator），一高通量的384x微电极板（E-Plate），一靶细胞，一待测化合物，一阻抗信号传递电缆。

其中，PC机/笔记本电脑安装有ACEA公司开发的实时细胞监控软件平台RTCA，该平台能控制细胞培养箱的环境参数，如：温度、湿度，以及二氧化碳浓度，从而保持细胞生长环境条件的一致性；并能实时检测微电极板E-Plate的阻抗变化信号，并将该信号转化成细胞指数（Cell Index，CI）显示在屏幕上，同时也存储在PC机/笔记本电脑硬盘中。

其中，384x微电极板置于细胞培养箱中，细胞培养箱的环境参数（温湿度，二氧化碳浓度）由实时细胞监控软件控制，从而保持在整个细胞暴露过程中稳定的环境条件。

其中，靶细胞接种在384x微电极板（E-Plate）中，靶细胞会贴壁生长，其数量变化会促使E-Plate底部的金箔传感器的阻抗发生变化，微电极上的贴壁细胞越多，阻抗值变化就越大，

其中，安装在PC机上的实时细胞监控软件通过电缆，获取阻抗信号变化，并将这种阻抗信号变化转化成细胞指数（CI），显示在系统中。

其中，在靶细胞接种在微电极板24小时后，在微电极板的不同微孔（well）中加入不同浓度的待测化合物，靶细胞的生长过程会受到该化合物的影响，或出现细胞增殖抑制，或出现死亡，实时细胞监控软件记录整个靶细胞的动态响应过程。

本发明的细胞毒性评估方法包括以下步骤：

1）将培养基加入384x细胞培养板的每个微孔中，RTCA检测培养基的阻抗信号变化，并自动扣除由培养基引起的阻抗信号变化的背景值；