[发明专利]一种高通量细胞毒性评估方法

权利要求书

1.一种高通量细胞毒性评估方法，所用的系统包括用于监测细胞生长和控制其生长环境参数的PC机或笔记本电脑、用于维持细胞生长环境的细胞培养箱、高通量的384x微电极板、靶细胞、待测化合物和阻抗信号传递电缆，PC机或笔记本电脑安装有ACEA公司开发的实时细胞监控软件，实时细胞监控软件通过电缆获取阻抗信号变化，并将这种阻抗信号变化转化成细胞指数显示在系统中，384x微电极板置于细胞培养箱中，靶细胞接种在384x微电极板中，其特征在于，该方法首先将靶细胞暴露在具有不同浓度的待测化合物中，并利用实时细胞监控软件记录整个靶细胞暴露过程的响应曲线；然后根据响应曲线所体现的细胞数量的变化，计算细胞毒性指标，该指标为靶细胞在整个指数增长期的数量变化，即靶细胞响应面积，且采用多浓度测试方法，得到基于靶细胞响应面积的“浓度-响应曲线”；最后，在“浓度-响应曲线”所反映的待测化合物细胞毒性随浓度变化规律的基础上，计算得到新的细胞毒性指标。

2.根据权利要求1所述的一种高通量细胞毒性评估方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1）将培养基加入384x细胞培养板的每个微孔中，实时细胞监控软件检测培养基的阻抗信号变化，并自动扣除由培养基引起的阻抗信号变化的背景值；

2）将定量的靶细胞接种到384x的细胞培养板的微孔中；

3）在室温的细胞培养箱中培育30分钟后，置于实时细胞监控软件的培养箱中；

4）接种24小时后，细胞进入指数增长期，此时细胞指数CI值达到1.0-1.2，用自动移液器将11个浓度的待测化合物添加到细胞培养板的微孔中；

5）实时细胞监控软件自动记录89小时的细胞指数CI值；

6）为减少实验内，每个微孔的初始接种细胞数量微弱差异，将实时细胞监控软件采集的细胞指数CI值归一化处理，得到新的细胞指数NCI，亦即：

NCI[k]=CI[k]CI[0]---(1)]]>

式中，CI[0]为刚注入待测化合物时，RTCA所记录的细胞指数值，k是RTCA软件的采样频率；

7）选择靶细胞的指数增长期为评估时间段，即：以正常对照组的细胞指数NCI最大值所在的时间为截止时间：

N=argmaxk{NCIc[k]}---(2)]]>

式中，NCI_c[k]为对照组的NCI指数值，N为截止时间；这样，避免了终点评估法需要确定最佳评估时间的弊端；

8）计算对照组细胞响应曲线的线下面积AUC_c，即：对照组响应曲线和细胞单位指数所构成的面积：

AUCc=Σk=2N(NCIc[k]+NCIc[k-1]-2)(t[k]-t[k-1)2---(3)]]>

其中，细胞单位指数即NCI=1，t[k]为采样时间；N为所选评估时间段，即：细胞指数增长期；AUC_c值的大小体现了靶细胞在整个指数增长期，细胞增殖的数量；

同时，计算靶细胞的暴露响应曲线与靶细胞的对照组响应曲线，在所选评估时间段所围成面积AUC_j，即：细胞对照组响应曲线与加入j^th浓度待测化合物所记录响应曲线之间的面积：

AUCj=Σk=2N((NCIc[k]-NCIj[k])+(NCIc[k-1]-NCIj[k-1]))(t[k]-t[k-1])2---(4)]]>

其中NCI_j[k]是待测化合物第j^th个浓度所对应的指数NCI值，j=1,2,…11为浓度值的代号；AUC_j值的大小体现了靶细胞在待测化合物作用下，相对于对照组，细胞死亡的数量，亦即：细胞毒性的大小；

9）计算得到靶细胞相对响应面积R(x_j)：

R(xj)=100×AUCjAUCc%---(5)]]>

其中x_j为待测化合物对应的浓度值，j=1，2，…，11；

10）用11个靶细胞相对响应面积R(x_j)和其相应的浓度x_j，采用非线性回归算法，得到评估该待测化合物细胞毒性的“浓度-响应曲线”方程：

R(x)=p1+p2-p11+exp(-log(x)-p3p4)---(6)]]>

其中x表示每个待测化合物的浓度，p₁、p₂，p₃，p₄为“浓度-响应曲线”方程的系数；

11）依据细胞“浓度-响应曲线”方程，算出新的细胞毒性评估指数AUC₅₀，也就是说，减少对照组响应曲线面积一半时，所需要待测化合物的浓度值，

AUC50=exp(-ln(p2-p150-p1-1)×p4+p3)---(7)]]>

AUC₅₀数值直接反映在整个细胞指数增长期，杀死对照组一半的增殖细胞所需要的待测化合物浓度大小，亦即反映了该待测化合物细胞毒性大小。

3.根据权利要求2所述的一种高通量细胞毒性评估方法，其特征在于，所述步骤5）中，实时细胞监控软件记录细胞指数CI值的记录频率为每小时记录一次。