[发明专利]一种检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料和食品添加剂检测领域，提供了一种检测17β-雌二醇的的电化学免疫传感器，可以用于检测食品中的17β-雌二醇。

背景技术

雌激素是一种G 18类固醇激素，目前在人体中发现的雌激素有三种：雌二醇、雌酮和雌三醇，其中雌二醇的生物活性最强。雌二醇可以和体内雌激素受体结合，改变内分泌系统正常的生理功。由于其合成代谢的作用而用于畜牧生产中以期促进增长，而低浓度的雌激素可以引起人类性发育的异常，减少人类精子的数量。在欧盟一些国家，雌激素已经禁止用于畜牧业。因此，迫切需要建立一种快速便捷的检测方法来检测环境中存在的雌激素的含量。目前检测17β-雌二醇的方法主要包括高效液相色谱法、气相色谱法等，但这些方法具有检测成本高，样品处理复杂且时间较长，仪器操作复杂等缺点。

发明内容

本文研究了一种快速便捷，灵敏度和精确度都较高的电化学免疫传感器检测食品中的17β-雌二醇，操作简单，成本低廉。在玻碳电极的表面修饰一层可以增加电化学信号的纳米复合物，然后将17β-雌二醇完全抗原通过和修饰在电极表面的金之间的静电引力吸附在电极表面。我们制备17β-雌二醇抗体和辣根过氧化物酶的标记层，将其和游离的17β-雌二醇的标准品同时滴加在电极表面，这样电极表面修饰的完全抗原和游离的标准品竞争结合标记的抗体。清洗电极以后，结合在电极表面标记层上的辣根过氧化物酶催化底物过氧化氢产生电信号。利用电信号的变化就可以达到待测物检测的目的。

本文发明内容之一是提供了一种新型电化学免疫传感器的制备方法。

本文发明内容之二是将制备的免疫传感器用于检测食品中的17β-雌二醇。

本文发明的技术方案，包括以下步骤：

1、检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器的制备步骤如下：

(1)石墨烯-聚苯胺的制备：

25 mg的GO溶于50 ml 1 mol/L H₂SO₄中，超声1 h，形成分散均匀的溶液。加入200 μL的苯胺单体再超声30 min。加入0.06 g的(NH4)₂S₄O₈，20 ℃超声2 h。得到的复合物通过过滤收集，60℃干燥。

(2) 抗体和辣根过氧化物酶标记层的制备：

 2 ml 1%的H₂PtCl₆·6H₂O加入到8 ml 水中，80℃搅拌状态下加入1%的硼氢化钠溶液，搅拌4 h，得到PtNPs。5.0 mg的多巴胺加入到5.0 ml PtNPs溶液中，用Tris–HCl将pH 调节至8.5，室温下搅拌5 h。离心用水清洗三次，得到多巴胺功能化的PtNPs。在将其加入到含有20 mg柠檬酸钠的HAuCl₄溶液中，室温下搅拌两个小时。离心清洗得到PDA-PtNPs-AuNPs纳米材料，溶于5 ml水中备用。100 μL，1mg/mL的辣根过氧化物酶 (HRP) 和100 μL，5 μg/mL的雌二醇抗体 (Ab)加入到2 ml的上述材料中，4℃下搅拌一夜。用PBS缓冲溶液清洗三次，得到纳米复合物标记层PDA-PtNPs-AuNP-HRP-Ab.

(3) 检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器的制备步骤如下：

5 mg GO-PANI超声1h溶于5 mL DMF中，滴加20 μL的GO-PANI溶液在玻碳电极表面，室温下晾干；将修饰的电极浸在含有1 mM HAuCl₄ and 1 mM H₂PtCl₆的0.2 M的Na₂SO₄溶液中，通过恒电位方法进行扫描还原，扫描电位为-0.2 V，扫描时间是300 s。这样在GO-PANI表面修饰了一成Au-PtNPs的纳米合金。滴加10 μl，10 μg/mL的17β-雌二醇完全抗原在修饰好的电极表面，室温下干燥5 h。用10 μl BSA (1%)封闭残余的活性位点。每一步修饰后用PBS缓冲溶液清洗电极。得到制备的免疫传感器电极，4℃储存备用。

2、如上所制备的一种检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器，用于检测17β-雌二醇的步骤如下：

(1) 滴加10 μl抗体标记层和10 μl游离的17β-雌二醇标准品在制备的电极表面，室温下培养30 min，用PBS缓冲溶液冲洗未结合的抗体和标准品。