[发明专利]抗禽流感H5N1血凝素抗原的人源化抗体及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗禽流感H5N1的血凝素（Hemagglutinin，HA）抗原的人源化抗体。此外，本发明还涉及该抗体的制备方法以及用途。

背景技术

禽流感是一种由甲型流感病毒的一种亚型引起的传染性疾病综合征。甲型流感病毒根据其表面蛋白质的不同被分为H1到H16等16种亚型。世界各地的禽流感主要由高致病性的H5和H7两种亚型引起，而人对其中的H1和H3亚型易感。高致病性禽流感H5N1病毒在亚洲造成成千上万的禽类死亡，并且疫情已经波及到中东地区、欧洲和非洲50多个国家。原本禽流感是只在禽类动物之间传播，但是随着进化，某些动物流感病毒株发生了变异，获得对人的致病性以及在人群中传播的能力，成为人类流感病毒。据世界卫生组织统计，自2003年起截止至2013年4月全球15个地区共确诊628名病例，374人死亡，病死率高达60%。

为了防止H5N1的流行传播，一些防止措施被广泛使用，比如疫苗，抗病毒药物及免疫治疗。目前有19种H5N1疫苗可以使用（http://www.who.int/influenza/resources/documents/characteristics_virus_vaccines/en/index.html），但是疫苗只能在预防阶段起作用。抗病毒性药物是个有效的途径，但是可供选择的种类比较局限。而基于抗体的被动免疫疗法在预防和治疗上都取得了很大的突破，成功应用于诸如甲肝病毒、乙肝病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒感染等。除此之外，1918年西班牙流感在全球爆发时，恢复病人的血清成功的降低了50%的治病率，而在中国用血清治疗H5N1感染也取得了成功。一些研究小组也成功制备了抗H5N1HA的单克隆抗体，并在小鼠模型中表现了预防和保护的功能（Sun,L.et al.PloS one,2009,4:e5476;Simmons,C.P.et al.PLoS medicine2007,4:e178;Prabhu,N.et al.Journal of virology,2009,83:2553-2562;Fleury,D.et al.Proteins,2000,40:572-578;Throsby,M.et al.PloS one,2008,3:e3942）。因此制备中和抗体是治疗和预防H5N1感染的重要途径。但是，由于目前杂交瘤技术制备的单克隆抗体都是鼠源抗体。随着使用单抗进行治疗病例数的增加，鼠单抗的弊端逐渐显露，主要是鼠源性抗体能引起人较为严重的免疫原性问题，产生人抗鼠抗体反应（Human anti-mouse antibody response，HAMA），HAMA可影响单抗的治疗效果，甚至可诱发过敏反应；其次，鼠单抗通常不能有效激活人体的生物效应功能，如补体依赖的细胞毒及抗体依赖的细胞毒作用；此外，鼠单抗在人体内半衰期也很短。为解决这些问题，诞生了多种抗体人源化改造技术，使抗体的免疫原性得到不同程度的降低，包括人鼠嵌合抗体（Chimeric antibody）和人源化抗体（Humanized antibody）。但不可否认抗体人源化改造费时、费力，改造后往往存在亲和活性降低、特异性下降等情况，而且或多或少存在免疫原性问题，因此人源性抗体也逐渐快速增长起来。

人鼠嵌合抗体即将鼠抗的可变区与人球蛋白的稳定区相连接，即抗体的Fab或F(ab/2)来源于鼠类，而Fc段来源于人类，既保留了抗体对抗原的特异亲和力，也可以部分降低HAMA反应。

人源化抗体是通过同源模建进行表面氨基酸残基人源化而制备得到。CDR-grafting是主要的人源化手段，将人抗体可变区中互补决定族（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列，使抗体既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲合力。由于这种CDR-grafted抗体只含有很少一部分鼠源蛋白成分（只有CDR来自小鼠），过敏反应大大降低并且对靶抗原又有较高的特异性和亲合力，在人体内的免疫原性被极大地降低，因此这种抗体的产生和发展，具有广泛的临床应用潜能。

综上所述，将禽流感H5N1单克隆鼠源抗体经过嵌合及人源化改造，使其既具有高中和活性，又能降低免疫源性，在今后禽流感H5N1预防和治疗中有广泛的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种抗禽流感H5N1血凝素抗原的人源化抗体。

本发明要解决的技术问题之二是提供该抗禽流感H5N1血凝素抗原的人源化抗体的制备方法。